用于智能手机的无源POCT尿酸检测系统设计∗

王文廉牛博怀王 玉

(1.中北大学仪器科学与动态测试教育部重点实验室,山西 太原030051；2.中北大学电子测试技术国家重点实验室,山西 太原030051)

尿酸(UA)是人体嘌呤核苷酸分解代谢过程中的最终产物,可作为高尿酸血症、痛风、肾综合征等疾病和Lesch-Nyhan综合征的生物标志物,此外,较高的UA水平意味着未来患得2型糖尿病及其并发症的风险更高[1]。因此,分析生物体液中的UA可以获得丰富的个人健康生理信息,在临床医学上具有重要的现实意义。一些医疗点设备允许在家里进行医疗自检,但不能完全覆盖不断增长的电子健康系统的诊断需求,现在仍需要大量的远程医疗设备以方便患者进行自我监测[2]。即时检测(POCT)的发展使临床诊断变得更节约成本、快速而易于使用,这一平台的意义在于它有可能使患者更频繁地在方便的情况下监测自己的健康状况,以便尽早诊断疾病[3]。医疗自检生物传感器中,电化学是一种常见的具有高稳定性和准确性的传感技术,已广泛应用于重要生物标志物的定量检测,如葡萄糖[4]、蛋白质[5]、电解质[6]、细菌[7]等。但这些检测手段需要熟练的人员或昂贵的设备来提供准确的结果,现在更多的电化学生物传感器越来越偏向于更便携灵活的检测设备[8－10]。

截止2019年11月全球手机用户达80亿[11],智能手机由于其无处不在的分布、国际连接和强大的构造,在便携式生物医学传感系统中扮演着越来越重要的角色,正改变着移动医疗和现场医疗检测的概念,加速了健康产业的发展。基于智能手机的UA电化学检测已经被描述,2018年Daizong Ji[12]等人设计了基于智能手机的集成伏安法系统,但通过OTG(On-The-Go技术)与手机有线连接的方式极大地限制了传感系统的灵活性和集成性,这对于连续实时读出是不方便的。近场通信(NFC)是一种射频识别(RFID)技术,它实现了设备之间的短距离无线通信[2]。NFC传感器为便携式、实时监控和定量检测生物标志物提供了新技术。NFC功能已被尝试在尿酸测量中,2015年Petar Kassal[13]等人利用了NFC短距离无线通信的优点设计了用于测量伤口尿酸含量的智能绷带,但没有摆脱使用电源模块的限制。这里设计了便携式尿酸检测传感器,利用具有NFC功能的智能手机可以无需物理连接地为电路供电并接收数据,可依附于手机配件用于POCT在多种场合进行尿酸自测。

POCT检测平台由传感器、检测电路和智能手机组成。基于柔性PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯)衬底的丝网印刷电极(SPE)通过交联尿酸酶对金工作电极进行了化学改性,并用作传感器。当智能手机靠近NFC天线时,NFC芯片获得从射频场接收的多余能量,驱动检测系统的其他各个组件开始工作。检测电路用于在传感器上施加电压并检测电流响应,测得的UA浓度值被发送到NFC芯片,通过NFC天线传输到智能手机,并显示在Android应用程序(APP)上。使用无源POCT检测系统对尿酸进行测量,计时安培法电流大小与尿酸浓度有良好的线性关系,并且检测结果显示出与参考仪器良好的一致性,同时应用于血清的真实样本测试,验证了该系统在POCT应用中的可行性。

1 理论与方法

1.1 仪器与试剂

使用到的试剂包括尿酸；尿酸酶(生物技术级,10μ/mg)；牛血清蛋白；戊二醛；壳聚糖；抗坏血酸(AA)；丙酮；无水乙醇；氯化钾；浓硫酸；氢氧化钾；谷氨酸；半胱氨酸；葡萄糖；PBS(pH 7.4),所有试剂均为分析级,购自国药集团化学试剂有限公司,实验用水为去离子水。用CHI660E电化学分析仪(上海辰华有限公司)进行了电化学表征；矢量网络分析仪(深圳市鼎阳科技有限公司,QG0703P_C01A)进行天线特征参数的测量；示波器(Tektronix,DPO5104B)检测电路模拟端输入；SPE电极在PET衬底(厚0.25 mm)上印刷,由工作金电极,辅助金电极和Ag/AgCl参比电极组成。

1.2 天线设计

图1 天线输入反射率仿真与验证

天线是一个定制设计的平面线圈,从手机产生的射频场中获取能量。为了能够使用移动NFC读取器进行读取,选择了40 mm×24 mm环形天线,在1.6 mm厚的FR4上有6匝。迹线的宽度为0.254 mm,迹线之间的间隙为1 mm。通过HFSS软件仿真可得f＝13.56 MHz时其等效电感值L1为1.989μH,S11图如图1(a),可以看到,在13.56 MHz频率处的S11达到了最小值(反射系数最小,此时的能量传递效率最高)。通过矢量网络分析仪测得实际天线等效电感值L2为1.284μH,S11图如图1(b)与仿真结果基本一致。CIC为NFC芯片内部电容50 pF,矢量网络分析仪测量天线寄生电容Cp为34 pF,根据公式(L值为测得的等效电感L2,fr为共振频率):

计算得到调谐电容Ctuning为18 pF,即可使标签天线共振频率在13.56 MHz。规定了天线的形状和调谐电容的大小即可完成该部分硬件电路的设计。

1.3 尿酸生物传感器的制备与改性

使用的SPE在PET基底上印刷了金工作电极、对电极和Ag/AgCl参比电极,并使用绝缘体油墨隔绝连接区与电化学反应区。其中工作电极呈圆形,直径为4 mm,酶和介体等生化活性物种可被固定化。该实验中工作电极用尿酸酶修饰,牛血清蛋白(BSA)的自由巯基连接蛋白质交联剂戊二醛固定尿酸酶,壳聚糖(CS)提供了整体的外界保护层。首先将2 mg尿酸酶与2 mg BSA和1μL 8%戊二醛溶液混合于200μL PBS(pH 7.4)中。将5μL混合溶液滴在工作电极上,室温干燥30 min,对工作电极进行功能化。接下来,电极表面滴涂5μL 0.2 wt%的壳聚糖溶液,干燥后放入4℃冰箱保存备用。SPE及其功能化如图2所示。传感器检测原理如反应式(2)和(3)所示。

图2 显示了尿酸酶SPE结构及改性

1.4 电化学系统评价

在无线电源和数据传输方面,我们用NFC智能手机(HUAWEI nova7)评估了POCT检测平台电化学检测电路的性能。为了设计更灵活的检测系统,所以要控制检测系统整体体积,但其和天线所留的净空区的大小相矛盾,我们分别设计了电路置于天线内和天线外的检测系统,测量了与智能手机的垂直距离从0到20 mm变化时对电路供电电压的影响。用万用表检测电源电压(NFC芯片的电压输出)。

为了评估恒电位电路(包括电压信号采集、处理和模数转换)的检测准确性和可靠性,设定模拟前端(AFE,Analog front end)输入0～2 V的三角波,使用示波器测试DAC输出同时与手机APP显示数据对比。

1.5 测定尿酸

根据先前的研究,人体液中生理浓度范围内的UA,包括血清240μmol/L～520μmol/L、尿液1.4 μmol/L～4.4μmol/L和唾液100μmol/L～250 μmol/L[14]。实际样品选择血尿酸(Blood UA,BUA)进行测量,因此,我们选择UA的典型浓度为0～800μmol/L。首先用商用的电化学工作站CHI66E测试了传感器的线性范围、稳定性和抗干扰性。然后使用无源POCT尿酸检测系统对同浓度的UA进行了测量并与电化学工作站所得结果进行比较。最后用于实际血液检测,并对结果进行了分析。该小节所有的测量都是在先前描述的SPE中进行的,使用计时安培法在0.35 V(vs.Ag/AgCl)的电压下工作60 s,记录工作过程。

2 结果与讨论

2.1 系统设计与操作

完整的POCT平台如图3(a)所示,共显示了系统的三个主要部分:①印制板电路(PCBs),用于信号处理、传输、电源管理和连接SPE；②智能手机,应用程序运行显示检测结果。这两部分通过NFC天线之间的感应耦合无线连接,进行电能和数据传输；③光敏树脂3D打印制造的外壳,以支撑整个系统作为配件依附于手机。

图3(b)PCB设计被分成两个不同的PCB。PCB1包含整个检测电路和射频(RF)天线,PCB2负责连接SPE。两部分通过排针垂直连接,这样的设计一方面是为了减小体积使PCB1被天线包裹,从天线内部垂直连接SPE,不会影响NFC天线,另一方面是为了使电极与智能手机保持距离,防止待测溶液损坏手机。

图3(c)说明的是检测系统电路框图。电路部分在功能上可分为六个部分,分别是NFC天线、NFC芯片、MCU、DAC芯片、恒电位电路和电极。当智能手机靠近NFC天线时,NFC芯片NT3H1101会自动唤醒,如果能量收集模式被激活并且磁场强度足够,高于阈值则NFC芯片获得从RF场接收的多余能量,驱动整个检测系统工作。该系统中NFC芯片被编程从射频中收集能量并调制输出的稳定电压2.75 V,直接为整个系统供电。通过其串行外围接口(I2C)总线与MCU进行通信,MCU内部自带模数转换器(ADC),用于将传感器采集到的模拟量转换为数字量,传给NFC芯片后放于SRAM缓存区,并快速传输数据于手机。智能手机开发的应用程序来控制NFC芯片的整个测量过程并可将数据保存下来以进行系统性分析。采用外部超低功耗数模转换器(DAC)MAX5530,在工作模式下仅需6μA的电流,为恒电位电路提供设定的电压输入。ADA4505运算放大器采用轨到轨输入与输出摆幅,每个放大器的工作电流小于10μA。由四个运算放大器处理三个电极的电压信号,包括偏置电路,恒电位电路和滤波电路,以输出稳定的模拟电压。整个系统在检测状态下,供电2.75 V,工作电流3.5 mA(消耗功率9.625 mW)。

图3 用于智能手机的尿酸POCT分析平台的图像和示意图

2.2 系统性能测试

基于传感器便携性的考虑,所以要尽量缩小硬件电路部分的体积,但净空区的减小会影响NFC芯片对手机产生RF场能量的收集,直接影响为整个系统供电。为此,我们分别设计了测试电路置于天线内和天线外的检测系统,打开手机NFC靠近贴片传感器为其供电,测量了其与智能手机的垂直距离从0到20 mm变化时对电路供电电压的影响。如图4为检测电路完全置于天线内与互相分离的两种电路设计,用万用表检测电路供电电压(NFC芯片输出电压)结果。可以看到两者都是在距离10 mm的位置电压迅速降低为0,此时检测电路几乎没有电压输入,所以在实际测量时应使其紧贴于手机进行测量。最终硬件电路的设计采用被天线包裹的方式。

图4 供电电压随检测电路与手机距离变化曲线

为了评估恒电位电路(包括电压信号采集,处理和模数转换)的检测准确性和可靠性,设定AFE输入0～2 V的三角波,使用示波器测试DAC输出同时与手机APP显示数据对比(APP得到的电压值V＝Vmax(2.75V)×Y(坐标值)/256)。并分别用实验室稳定电源装置标准电压输入2.75 V和通过NFC芯片感应手机射频场供电进行对比,如图5为在设定输入电压下示波器和手机显示结果。

图5 示波器测试DAC输出与手机APP显示数据对比

2.3 对尿酸的反应

首先,用电化学工作站CHI66E评估了尿酸酶SPE的电化学性能。为了覆盖高尿酸血症患者在诊断和治疗应用中的UA水平,在电流响应中测试了动态浓度范围为0～800μmol/L浓度的UA。图6(a)显示了UA浓度以100μmol/L增量递增的计时安培图。数据表明,SPE尿酸酶生物传感器对UA非常敏感,并具有宽线性范围。相应的电流响应与UA浓度成正比,响应结果如图6(d)中曲线A,线性校准曲线为y(μA)＝0.0186x(μmol/L)＋0.1704(R2＝0.9973)。

实际测量时由于人的体液,如血液,是包含多种干扰物的较复杂的基质,因此需要确保对于实际应用的选择性。如图6(b)所示,通过在固定电位和搅拌条件下连续测量来评估选择性,在0.1 mmol/L UA在连续加入1 mmol/L谷氨酸、半胱氨酸；5 mmol/L的葡萄糖；10 mmol/L的NO2－、Na＋、K＋、Cl－、Ca2＋；0.18 mmol/L抗坏血酸；0.1 mmol/L UA。在一些常见电活性物质存在下,干扰物对UA电流信号没有显著影响(RSD<5%),这是由于尿酸氧化酶的特异性使生物传感器高度适用于UA。

接下来,通过在2 h内以10 min的间隔对400μmol/L UA的响应来进行稳定性测试,证实了连续监测的可行性。图6(c)说明相应的计时电流图非常稳定,在整个延长的操作过程中都没有明显变化(RSD＝3.5%)。

使用无源尿酸检测系统同样测试了动态浓度范围为0～800μmol/L浓度UA电流响应,滴加待测液覆盖电化学反应区域即可,完整POCT尿酸检测系统测量过程如图7(a)所示,每次检测时长60 s。响应结果如图7(b)所示,相应的电流响应与UA浓度成正比,线性校准曲线为y(μA)＝0.0186x(μmol/L)＋0.2189(R2＝0.9946)。UA生物传感器在与仪器无关的整个生理浓度范围内表现出良好的线性关系,且电化学工作站与无源POCT尿酸检测系统两种仪器之间具有良好的一致性(最大相对误差为6.2%)。

图6 尿酸酶SPE的电化学性能测试

图7 POCT尿酸检测系统测试

为进一步探究系统的实用性,帮助验证所开发的传感器在现场医疗监测健康状况方面的效用,在高尿酸血症患者和健康志愿者两种类型的志愿者中检测了BUA水平,收集人体原始血清样品,用PBS(0.1 mol/L,pH＝7.4)溶液将血清稀释10倍,按分析方法操作测定,并用标准加入法进行样品回收率实验,结果见表1。从表1中可见,该传感器对血清样品中尿酸浓度检测的结果令人满意。

表1 血清中尿酸的测定及回收率

3 结论

本工作描述了一种可用于即时检测UA的新型电化学生物检测系统,使用NFC技术依附于智能手机实现无源无线的工作模式,这极大地提高了系统的灵活性和小型化。使用简单快捷,只需滴涂待测液于SPE并将POCT平台靠近手机即可,方便患者在多种场合下进行自我监测。用计时安培法验证了电化学反应电流与UA浓度的线性关系,整个系统的检测结果与参考仪器有良好的一致性。同时,实际样品血清的检测结果进一步表明该系统在即时医疗高度的可用性。未来的努力将尝试改进Android应用程序以显示更为详细的信息,帮助患者进行健康监测和疾病诊断。