体外亚硝化模拟体系优选阻断NPYR生成的复合香辛料精油配比

陈文静,任小青,杨 华,马俪珍,*

(1.天津农学院食品科学与生物工程学院,天津 300384; 2.天津农学院动物科学与动物医学学院,天津 300384)

近年来,随着我国经济实力的迅速增长,食品加工行业的安全问题也愈来愈被重视。在肉制品的加工领域,亚硝酸盐作为食品添加剂被广泛使用,这是因为亚硝酸盐可以使肉制品呈现稳定的红色,抑制有害细菌的生长繁殖,并且在贮藏过程中可以抑制产品中脂类的氧化,进而延缓食品的腐败,还可以改善肉类的风味[1-2]。但是,亚硝酸盐在弱酸性条件下,极易与腌肉制品中富含的蛋白质分解产物——胺类化合物发生亚硝化反应,最终生成具有致癌致畸致突变的危害物(N-亚硝胺)[3]。因此,在腌肉制品加工中,常常通过添加亚硝化抑制剂来减少或抑制N-亚硝胺的生成[4]。

目前,国内外对于如何控制N-亚硝胺的形成研究主要集中在寻找天然亚硝化抑制剂,如VC、VE、茶多酚[5]、香辛料精油(Spices essential oil,SEO)[6-8]等,其中SEO不仅具有独特的气味,可以矫味、增色,还具有抑菌、防腐、抗氧化等作用[9-11]。SEO阻断N-亚硝胺的机理是利用其抗氧化成分(如醛类、醇类、烯类等),通过反硝化途径,将亚硝化试剂N2O3还原为N2、NO等,进而有效清除亚硝酸盐残留量,阻断N-亚硝胺的生成。黄建蓉等[12]研究发现,花椒精油与八角精油按一定比例复配后,其对亚硝酸钠的清除能力具有协同增效作用。尹立辉等[8]研究发现,0.2%的八角精油和0.2%的丁香精油对腊肠中N-二甲基亚硝胺(N-nitrosodimethylamine,NDMA)的阻断率分别为87%和79%。汪思顺等[13]将3.81 mL的大蒜提取液分别加入到腌肉和腌鱼中,其对亚硝酸盐的清除率为85.04%和80.79%。丁城等[14]研究发现50 mL 2%的辣椒提取液对亚硝酸盐的清除率高达98.6%。

前期研究中,考虑到NDMA是N-亚硝胺中毒性很强的一种,且我国在GB 2762-2017《食品安全标准 食品中污染物限量》中对NDMA限量做出了规定,肉及肉制品(肉制罐头除外)中含量不得超过3.0 μg/kg,所以本实验室将优选的阻断NDMA生成的复合香辛料精油(Compound spices essential oil,CSEO)[15]应用到西式培根加工中,发现其可以显著降低西式培根中NDMA以及其他几种N-亚硝胺的含量[16]。但是,西式培根产品中N-亚硝基吡咯烷(N-nitrosopyrrolidine,NPYR)的含量偏高(3.89～7.39 μg/kg),虽然我国未颁布相应的标准规定肉及肉制品中NPYR的含量,但美国食品药品监管局规定在美国市场上销售的肉制品所含有的NPYR不得超过10 μg/kg[17]。因此,从保证西式培根的安全品质考虑,本试验以阻断NPYR的形成为考核目标,筛选能够有效阻断NPYR的CSEO。

响应面设计法[18-20]是利用合理的试验设计方法并通过试验得到数据,采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系,通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数,解决多变量问题的一种统计方法。本研究采用单因素实验和响应面中心组合试验设计相结合的方法,先从肉制品中常用的8种市售SEO(花椒、八角、青花椒、丁香、迷迭香、黑胡椒、姜油、当归风味生姜、砂仁)中选出对NPYR抑制率较好的5种,再用响应面中心组合试验设计筛选出这5种SEO的最佳配比。最后,将优选的CSEO进行验证试验,除对NPYR的抑制效果外,也同时考察了对NDMA的抑制率,目的是为CSEO将来在西式培根等腌肉制品中的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

市售常用的8种超临界萃取SEO(花椒精油、八角精油、青花椒精油、丁香精油、迷迭香精油、黑胡椒精油、当归风味姜油、砂仁精油) 天津市春合科技开发有限公司;乳化剂(PEG8000)、柠檬酸钠、盐酸、α-萘胺、无水乙醇、无水对氨基苯磺酸、亚硝酸钠、二甲胺盐酸盐、碳酸钠 均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司。

STARTER3100酸度计 美国Ohaus公司;18Basic匀浆机 德国IKA公司;XMTD-4000电热恒温水浴锅 上海科恒实业发展有限公司;NO.NU-425-400E超净工作台 天美(中国)科学仪器有限公司;T6新世纪型紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 体外模拟亚硝化乳化体系的制备 参照马俪珍等[21]的方法,并稍作修改。按照试验设计,分别吸取不同体积的SEO至50 mL带螺帽的离心管内,均加入0.05 g PEG8000,再加入一定体积的0.5 mol/L柠檬酸钠-盐酸缓冲液(pH3.0),使其总体积为10.0 mL。用匀浆机B挡(13000 r/min)乳化处理1 min后,取1.0 mL配制好的乳液至50 mL带螺帽的离心管中,依次加入0.5 mol/L柠檬酸钠-盐酸缓冲液(pH3.0)5.0 mL,1 mmol/L亚硝酸钠0.5 mL,1 mmol/L吡咯烷盐酸盐0.5 mL,3 mL的缓冲液,使反应体系的总体积为10.0 mL,在37 ℃下水浴反应1 h。

1.2.2 NPYR的测定方法 按照1.2.1体外模拟亚硝化反应结束后,参照马俪珍等[21]的方法,取1.0 mL反应的溶液至玻璃试管中,加入0.5%碳酸钠溶液0.5 mL终止其反应,将其置于超净工作台内的15 W紫外灯下照射15 min(试管液面距灯管之间的距离为15 cm),取出立即依次加入1%对氨基苯磺酸1.5 mL(摇匀)、0.1%α-萘胺1.5 mL(摇匀)、0.5 mL缓冲液至溶液体积精确至5.0 mL,摇匀,静置15 min 显色后在波长525 nm下比色测定其吸光度。

1.2.3 单因素实验 研究不同体积浓度的8种SEO乳液对NPYR的抑制率。按1.2.1的方法将8种SEO分别吸取0.00、0.05、0.50、1.00、1.50、2.00 mL,使每种SEO在体外模拟亚硝化反应中的终浓度分别为0.0、0.5、5.0、10.0、15.0、20.0 mL/L,反应结束后,按1.2.2进行NPYR的测定,空白对照组为不加香辛料精油的空白乳液,计算每一种SEO在对应体积浓度时对NPYR的抑制率,试验重复3次。

1.2.4 响应面中心组合试验设计 在单因素实验结果的基础上,最终以花椒精油体积浓度(A,330.0～470.0 μL/L)、八角精油体积浓度(B,300.0～370.0 μL/L)、青花椒精油体积浓度(C,13.0～20.0 μL/L)、丁香精油体积浓度(D,10.0～17.0 μL/L)和迷迭香精油体积浓度(E,100.0～170.0 μL/L)为影响因素水平,以NPYR抑制率为响应值,使用Design-Expert 7.0软件,依据中心组合试验设计原理设计响应面优化分析试验。因素水平编码表如表1所示。

表1 响应面试验因素及水平编码值Table 1 Response surface test factors and level coding values

1.2.5 验证试验 按照1.2.4将响应面中心组合试验设计得出的CSEO最优配比添加到体外模拟NPYR形成的体系中,进行6次重复验证试验。为了解所优选CSEO对NDMA的抑制效果,也同时测定了CSEO对体外模拟体系中NDMA形成的抑制率。

1.2.6 NPYR和NDMA抑制率的计算

式中:A0为不加入SEO的空白乳液时的吸光度值；Ax为加入SEO乳液时的吸光度值。

1.3 数据处理

用 Microsoft Excel 2010对试验数据进行预处理,Statistix 8.1进行数据分析,通过Turkey test程序进行显著性差异(P<0.05),Sigmaplot 10.0作图。响应面试验采用Design-Expert 7.0设计并进行结果分析,通过建立回归方程、绘制等高线和响应面图,对任意两种因素的交互效应进行分析评价。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

8种不同添加浓度SEO对NPYR抑制率变化见表2。由表2可知,除砂仁精油外,其他7种SEO对NPYR的形成均有不同程度的抑制效果。其中,迷迭香精油对NPYR的抑制率最强,在0.5～20.0 mL/L的体积浓度范围内,随着体积浓度的增加,抑制作用也显著增强(P<0.05)；花椒精油在0.5～20.0 mL/L的体积浓度范围内,从0.5 mL/L增加到5.0 mL/L时,对NPYR的抑制率从57.93%迅速增加到74.76%(P<0.05),之后随着体积浓度的增加,抑制率仅有很小幅度的升高(从74.76%升高到77.52%),说明花椒精油在5.0～10.0 mL/L体积浓度就可以达到较好的抑制效果；而当青花椒精油的体积浓度仅为0.5 mL/L时,对NPYR的抑制率就已达到79.37%,若体积浓度继续增加,则对NPYR抑制率反而呈降低趋势；丁香精油和八角精油在0.5～15.0 mL/L的体积浓度范围内,对NPYR的抑制率与其浓度均呈现正相关关系；黑胡椒精油体积浓度从0.5 mL/L增加到5.0 mL/L时,对NPYR的抑制率从15.70%迅速增加到45.23%(P<0.05),之后随着体积浓度的增加,抑制率反而呈显著降低趋势(P<0.05)；当归风味姜油与黑胡椒精油的变化趋势基本一致。

表2 8种不同浓度香辛料精油添加对NPYR抑制效果Table 2 Inhibition effect of 8 different concentrations of essential oils on NPYR

由于SEO风味醇香浓厚,单一使用某一种SEO需要较高的浓度(除青花椒精油外,花椒精油、八角精油、迷迭香精油、丁香精油的体积浓度应在15.0 mL/L以上,如表2所示)才能对NPYR的抑制率达到组内最大值,然而在实际应用中要考虑到产品的复合风味,不可能添加如此高浓度的单一SEO。此外,虽然当归风味姜油在每一个体积浓度上,对NPYR的抑制率都高于八角精油,但是当归添加到肉制品中的风味微苦,而八角是肉制品加工中常用的一种香辛料,具有广泛的应用价值[22],所以最终确定在响应面中心组合试验设计中,以花椒精油、八角精油、青花椒精油、丁香精油和迷迭香精油为自变量进行响应面优化试验。这5种超临界萃取SEO复配时零水平的浓度确定原则,主要是根据单因素实验结果。由表2可知,花椒精油和八角精油的体积浓度在5.0 mL/L左右即可以达到较好的抑制效果；青花椒精油的体积浓度为0.5 mL/L时,抑制效果最佳；丁香精油和迷迭香精油的体积浓度在0.5～5 mL/L之间的抑制效果较好；综合考虑,最终确定其单因素实验的体积浓度分别为6.0、5.0、0.25、2.0、2.0 mL/L,在此基础上因为是5种超临界萃取SEO复配且超临界萃取SEO风味浓郁醇厚,所以只选取单因素实验时体积浓度的1/15,而丁香精油(香气浓郁)的体积浓度为迷迭香精油最终体积浓度的1/10。最终确定花椒精油、八角精油、青花椒精油、丁香精油和迷迭香精油复配时零水平的体积浓度分别为400.0、335.0、16.5、13.5和135.0 μL/L。

2.2 响应面中心组合试验

以单因素实验结果为依据,选取花椒精油(A)、八角精油(B)、青花椒精油(C)、丁香精油(D)和迷迭香精油(E)5个因素为自变量,使用Design-Expert 7.0软件,通过中心组合试验设计原理进行5因素3水平的响应面优化分析试验,研究其对NPYR抑制率(Y)的影响。

2.2.1 回归模型的建立与显著性检验 响应面中心组合试验设计及结果见表3。

表3 响应面中心组合试验设计及结果Table 3 Design and results of response surface center combination test

利用软件Design-Expert 7.0对上述试验结果进行多元线性回归分析,可建立抑制率(Y)对花椒精油(A)、八角精油(B)、青花椒精油(C)、丁香精油(D)和迷迭香精油(E)的二次回归方程:Y=70.01+0.013A+0.022B+0.026C+0.031D+0.030E+0.058AB+0.085AC+0.017AD+0.058AE-0.037BC+0.075BD+0.010BE+2.500E-003+0.035CE+0.043DE-0.55A2-0.54B2-0.51C2-0.54D2-0.55E2。

表4 响应面试验回归模型方差分析Table 4 Analysis of variance of response surface test regression model

2.2.2 响应曲面和等高线图分析 通过Design-Expert 7.0软件绘制的响应曲面和等高线图,可以更为直观地反映出研究因素及其交互作用对NPYR抑制率的影响,响应曲面图中曲线弯曲度越大,说明研究因素对NPYR抑制率影响越大[28-29]；等高线呈现椭圆形,则说明研究的各因素之间交互作用显著,而圆形则说明交互作用不显著[30-31]。通过拟合模型的回归方程所作的各因素之间交互作用的响应面分析见图1所示。如图1所示,花椒精油和青花椒精油之间的交互作用显著,将花椒精油的体积浓度固定后,NPYR抑制率随着青花椒体积浓度的升高呈现先增加后降低趋势,且其等高线图呈椭圆形,青花椒精油的体积浓度一定时,NPYR抑制率随着花椒精油体积浓度的增加先升高后降低。图1显示,八角精油和丁香精油之间的交互作用也达到了显著水平(P<0.05),当八角精油在一定体积浓度时,对NPYR的抑制效果随着丁香精油体积浓度的增加先升高后降低,反之,也呈现相同的变化趋势。这就说明,花椒精油和青花椒精油、八角精油和丁香精油之间的交互作用对NPYR的抑制作用都比较大,该分析结果与方差分析结果一致。

图1 花椒和青花椒、八角和丁香精油相互作用对NPYR抑制率的响应面和等高线图Fig.1 Response surface and contour plots of the interaction between pepper and green pepper,star anise and clove essential oil on NPYR inhibition rate

2.2.3 最佳工艺条件预测与验证试验 根据Design-Expert 7.0软件预测得出抑制NPYR的CSEO最优配比,为花椒精油441.0 μL/L、八角精油337.0 μL/L、青花椒精油17.0 μL/L、丁香精油14.0 μL/L和迷迭香精油137.0 μL/L。此时,NPYR抑制率的预测结果为69.84%。将此条件下的CSEO在体外模拟NPYR形成的体系中进行验证试验,试验测得NPYR抑制率为68.40%±0.33%,与预测值基本相符,说明运用响应面法优化得到的模型参数准确可靠,具有实际应用价值。再将此最优配比在体外模拟NDMA形成的体系中进行验证试验,试验测定对NDMA抑制率为66.69%±0.43%。

本试验采用响应面中心组合设计得到的最优配比,对NPYR的抑制率为68.40%±0.33%(验证试验值)。此结果比单因素实验中最高的NPYR抑制率(迷迭香的体积浓度为20.0 mL/L,对NPYR的抑制率为85.70%)要略低,这是因为考虑到在肉制品的实际生产加工中SEO添加量对肉制品风味的影响,筛选的最优配比中各SEO的体积浓度均远低于使用单一SEO时的最高浓度。

3 结论

单因素实验结果表明,在体外模拟亚硝化体系中,除砂仁精油外,其他7种SEO对NPYR的生成均有不同程度的抑制作用,抑制率大小与其添加浓度有一定关系。响应面中心组合设计试验得到由5种SEO组合的CSEO,最优体积浓度配比为:当花椒精油、八角精油、青花椒精油、丁香精油和迷迭香精油的体积浓度分别为441.0、337.0、17.0、14.0和137.0 μL/L时,由模型优选得出对NPYR抑制率的预测值为69.84%,验证试验得出的抑制率为68.40%±0.33%,说明得到的模型与实际拟合度较好,具有实用价值。此配比对NDMA的抑制率为66.69%±0.43%。