猴耳环多酚的大孔树脂纯化工艺及其组分分析

李志超 傅咏梅 张蜀 陈湘澜 谢振辉 邓红

摘  要：建立并優化猴耳环多酚的纯化工艺并对其组分进行定性分析。本研究以猴耳环多酚粗提物为原料，以吸附及解吸附效果筛选了最优大孔树脂，再以吸附、解吸附和纯度为评价指标，考察各工艺参数对AB-8树脂纯化多酚的影响，最后采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱（UPLC-Q-TOF-MS）法进行多酚组成定性分析。结果表明：优选 AB-8树脂，粗提物以质量浓度3 mg/mL、流速1 mL/min上样10 BV（柱体积：1 BV=10 mL），水洗后，用60%乙醇5 BV以1 mL/min的流速洗脱。在此工艺条件下，多酚纯度达到58.64%。UPLC-Q-TOF-MS定性分析了纯化后猴耳环多酚14种组分。建立的猴耳环多酚的纯化工艺稳定可行，实现了其组分定性分析，为进一步研究提供了依据。

关键词：猴耳环多酚;纯化工艺;大孔树脂;超高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱（UPLC-Q-TOF-MS）

中图分类号：R282.71;TQ28      文献标识码：A

Macroporous Resin Purification Process and Component Analysis of Pithecellobium clypearia Polyphenols

LI Zhichao1， FU Yongmei3， ZHANG Shu1，2， CHEN Xianglan1， XIE Zhenhui1， DENG Hong1，2*

1. Key Laboratory of New Drug Dosage Form， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou， Guangdong 510006， China; 2. Guangdong Provincial Precision Medicine Drug Delivery Preparation Engineering Technology Research Center， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou， Guangdong 510006， China; 3. Sinopharm Group Guangdong Global Pharmaceutical Co.， Ltd.， Foshan， Guangdong 528000， China

Abstract： The aim of the study was to establish and optimize the purification process of Pithecellobium clypearia polyphenols and qualitatively analyze its components. In this study， the crude polyphenol extract of P. clypearia was used as the raw material， and the optimal macroporous resin was screened based on the adsorption and desorption effects. Taking adsorption， desorption and purity as the evaluation indexes， the influence of various technological parameters on the purification of polyphenols by AB-8 resin was investigated. Finally， the ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight tandem mass spectrometry （UPLC-Q-TOF-MS） method was used for qualitative analysis of polyphenol composition. AB-8 resin was preferred， the crude extract was loaded with 10 BV at a mass concentration of 3 mg/mL and a flow rate of 1 mL/min （column volume： 1 BV=10 mL）， after washing with water， eluted with 60% ethanol 5 BV at a flow rate of 1 mL/min. Under this process condition， the purity of polyphenol reached 58.64%. UPLC-Q-TOF-MS qualitatively analyzed 14 components of purified. The purification process of the established P. clypearia polyphenols was stable and feasible， and the qualitative analysis of its components was realized， which would provide a basis for further research.

Keywords： Pithecellobium clypearia polyphenol; purification process; macroporous resin; Ultra performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry （UPLC-Q-TOF-MS）

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.04.032

猴耳环（Pithecellobium clypearia Benth）为豆科（Leguminosae）猴耳环属（Pithecellobium）乔木[1]。猴耳环喜阳光充足、温暖湿润的生长环境，主要分布在我国的广东、云南、广西、海南等省（区），以及东南亚地区，国内野生资源接近枯竭[2]，主要从东南亚地区进口。但近几年人工种植得到发展，广东惠州梁化林场原山种植超过1300 hm2。现代《广东中药材标准》中记载猴耳环微苦、涩、微寒。归脾、胃、肝经。具有清热解毒、凉血消肿和止泻等功效[3]。猴耳环作为特色南方药材，其水提浸膏制剂收载于《中国药典》2015版一部[4]，在临床治疗上呼吸道感染以及咽喉炎等取得良好疗效。猴耳环多酚作为其主要成分，具有良好的药理活性。迄今为止，从猴耳环中分离得到的多酚类化合物有表没食子儿茶素、槲皮苷、杨梅苷、特利色黄烷及其没食子酸酯类物质等40多种[5]。研究报道猴耳环多酚类物质具有抗氧化[6]、抗炎[7]、抗病毒[8]等药理活性。

本课题组前期通过响应面优化法建立了猴耳环多酚的超声波辅助溶剂提取工艺，但由于获得的粗提物含有较多杂质，因此有必要对猴耳环粗提物进行富集纯化，从而实现进一步的深入分析。而大孔吸附树脂法，操作简便、吸附速度快、吸附量大、选择性好、所得样品纯度高[9]，在多酚的纯化研究中被广泛应用。超高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱（UPLC-Q-TOP-MS）法分离效果好，速度快，可以实现对分子量的精准测定[10]，适用于猴耳环多酚成分的定性分析。

目前关于猴耳环多酚的研究报道主要表现在对其单体成分的分离以及药理作用的研究，而对多酚整体的提取纯化工艺研究鲜有报道，因此，本研究利用大孔树脂，通过静态以及动态实验筛选最优树脂，并对工艺参数进行考察，建立并优化猴耳环多酚的纯化工艺;同时采用UPLC-Q- TOP-MS法对纯化后猴耳环多酚组分进行分析，旨在为猴耳环多酚的开发应用提供理论基础。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  药材与试剂  猴耳环（批号：FUN- 20190520），采集于广东态合堂实业有限公司广东惠州梁化林场基地，自然晾干，备用。

没食子酸标准品（批号110831-201605，纯度90.8%），中国食品药品检定研究院;AB-8、D101、HPD100、HPD826、DM130、NKA-9大孔吸附树脂，沧州宝恩吸附材料科技有限公司;福林酚（1 mol/L），麦克林试剂公司;甲醇、甲酸均为色谱纯，其余试剂均为市售分析纯，水为蒸馏水。

1.1.2  仪器与设备  HWS-26电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司;UV-1800紫外可见分光光度计，日本SHIMADZU公司;超高效液相色谱串联四极杆/飞行时间质谱联用仪，美国Waters公司;BS-423S型电子分析天平，德国Sartorius公司;SK7200LHC超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司。

1.2  方法

1.2.1  猴耳环粗提物制备  取猴耳环叶粉碎备用。70%乙醇以液料比30∶1（mL/g），超声提取40 min（频率53 kHz，功率350 W），得到提取液旋蒸浓缩并真空干燥得到粗提物。

1.2.2  猴耳环多酚含量测定  按福林酚比色法[11]测定。以没食子酸为对照品，在波长753 nm下测定吸光值。得到回归方程为：y=0.0138x+0.0213（R2=0.9998），线性关系良好，可以用于猴耳环多酚的含量测定。

1.2.3  大孔树脂优选  按文献[12]预处理，将新购买的大孔树脂依次用95%乙醇、5%氢氧化钠溶液、4%盐酸溶液浸泡24 h，水洗后，于70%乙醇溶液中保存备用。分别取不同类型大孔树脂（AB-8、HPD-100、HPD-826、NKA-9、DM-130 D-101）适量，滤纸吸干表面水分，称取1.0 g，置100 mL具塞锥形瓶中，加入上样液40 mL（3 mg/mL粗提物溶液），放入水浴恒温振荡器中，30 ℃、100 r/min振荡24 h。并分别在1、2、4、6、8、24 h吸取1 mL清液后按1.2.2方法测定多酚含量，并按式（3）计算不同时间的吸附率。24 h后将大孔树脂取出，滤纸吸干表面提取液，置100 mL锥形瓶中，加入60%乙醇溶液50 mL，放入水浴恒温振荡器中，30 ℃、100 r/min振荡24 h，于1、2、4、24 h吸取1 mL上清液。按1.2.2方法测定多酚含量，并按式（4）计算解吸附率。

式中：Q1为吸附量，mg;C0为样品液中多酚浓度，mg/mL;C1为吸附后样品液中的多酚浓度，mg/mL;V1为样品液体积，mL;Q2为解吸附量，mg;C2为解吸附后的多酚浓度，mg/mL;V2为解吸附溶剂体积，mL;R为吸附率，%;D为解吸率，%。

1.2.4  纯化工艺参数考察  上样量考察：称取1.2 g粗提物，加400 mL水，超声溶解制成每mL含3 mg粗提物的混懸液，按1.2.2测定其多酚浓度为1.13 mg/mL，取混悬液上柱吸附，流速1 mL/min，分段收集流出液，并测定其多酚浓度。

上样液浓度的筛选：称取0.3 g粗提物粉末5份，分别用300、100、60、43、34 mL水超声溶解制备1、3、5、7、9 mg/mL的混悬液，上柱吸附，流速1 mL/min，收集流出液，计算吸附率。

上样流速的筛选：取浓度为3 mg/mL的上样液10 BV（5份），上柱吸附，流速分别设置为0.5、1、2、4、6 mL/min，收集流出液，计算吸附率。

上样pH筛选：取浓度为3 mg/mL的上样液10 BV（5份），分别调节pH为2.73、3.71、4.82（样品原溶液）、6.02、7.02，上柱吸附，流速为1 mL/min，收集流出液，计算吸附率。

洗脱液浓度的考察：取浓度为3 mg/mL的上样液10 BV（6份），分别以柱流速1 mL/min上柱吸附，收集流出液，计算吸附量，后分别用体积分数为10%、30%、50%、60%、70%和90%的乙醇5 BV以1 mL/min的流速洗脱，收集洗脱液，计算解吸率，并将洗脱液分别冷冻干燥处理后测定所得样品的纯度。

洗脱流速的考察：取浓度为3 mg/mL的上样液10 BV（5份），分别以柱流速1 mL/min上柱吸附，收集流出液，计算吸附量，取60%乙醇5 BV（5份），分别以流速为0.5、1、2、4、6 mL/min洗脱，收集洗脱液，计算解吸率。

洗脱剂用量考察：取浓度为3 mg/mL的上样液10 BV，以1 mL/min 流速上柱，收集流出液，计算吸附量，用60%乙醇溶液以1 mL/min的洗脱流速进行解吸，分段收集洗脱液并测定其多酚浓度。

1.2.5  纯化工艺验证  取浓度为3 mg/mL的上样液10 BV，以柱流速1 mL/min上柱吸附，收集流出液，计算吸附量。用60%乙醇以1 mL/min的流速洗脱5 BV，洗脱液冷冻干燥处理得猴耳环多酚。平行操作3次，以1.2.2的方法測定猴耳环粗提物以及纯化后猴耳环多酚的纯度。

1.2.6  猴耳环多酚组分分析  色谱条件：色谱柱：ACQUITY UPLC T3 C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）Waters公司，预柱：ACQUITY UPLC BEH C18 Van Guard Pre-Column（2.1 mm×5 mm，1.8 μm）Waters公司，流动相A：甲醇，流动相B：0.1%甲酸，洗脱程序如下：0.00～2.00 min，6%～ 21% A;2.00～4.00 min，21%～23% A;6.00～ 7.00 min，27%～31% A;7.00～10.00 min，31% A;10.00～12.00 min，31%～36% A;12.00～16.00 min，36% A;16.00～17.00 min，36%～42% A;17.00～ 22.00 min，42%～44% A;流速：0.3 mL/min，柱温30 ℃，进样量为3 μL。

质谱条件：采用电喷雾离子源（ESI），正、负离子模式监测，数据采集范围m/z 100～1500;碰撞气体：氦气。

供试品溶液制备：取纯化后猴耳环多酚粉末0.5 g，置于25 mL具塞锥形瓶中，加甲醇溶解后摇匀，以0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

定性分析：取供试品溶液按1.2.6条件进行UPLC-Q-TOF-MS检测，获得正、负离子模式下的供试品总离子流图（TIC）。利用MassLynx（美国Waters公司）软件进行峰检测，根据质谱碎片信息和相关文献定性分析猴耳环多酚中的化学成分。

1.3  数据处理

每项试验至少重复3次，结果以平均值±标准差表示，采用Excel软件进行数据分析，采用Origin 9.0软件完成绘图。

2  结果与分析

2.1  大孔树脂优选

由图1可知，在吸附率曲线中，大孔树脂DM-130的多酚吸附率低，对比其余5类吸附曲线，AB-8的多酚吸附率最高;在解析率曲线中，不同大孔树脂的最终解吸率相近，而AB-8与HPD-100的1 h后解吸附率高，说明解吸附速率快，二者AB-8解吸附性能略佳，同时结合价格因素考虑，优选AB-8进行纯化工艺因素考察。

2.2  纯化工艺参数考察

2.2.1  上样量  由图2 结果可以看出，随着上样量的增加，流出液中多酚的浓度不断增加，在上样量达到10 BV时，达到初步的吸附平衡，此时流出液多酚溶度约为上样溶液多酚含量的10%，此后，增大上样体积，流出液多酚浓度继续增加。

综合考虑吸附量与生产效率[13]，确定最佳上样条件为3 g/mL的粗提物溶液以上样流速1 mL/min上样10 BV。

2.2.2  上样浓度  由图3可知，当上样浓度为2.0～3.0 mg/mL时，AB-8树脂吸附率随粗提物浓度的增大而升高，3.0 mg/mL对应吸附率最大，这与低浓度有利于吸附原则相符[14];当上样浓度

高于3.0 mg/mL时，吸附率下降。上样浓度大则上样溶液的多酚物质更加密集，对于大孔树脂的吸附存在竞争，同时上样浓度过大，会堵塞大孔树脂柱[15]，影响再生使用。因此，优选上样浓度为3.0 mg/mL。

2.2.3  上样流速  上样流速是影响猴耳环多酚纯化效果的关键因素。由图4可知，随上样流速增快，多酚吸附率不断下降。可能由于上样流速较慢时，树脂与多酚的接触时间长，利于多酚的扩散，使大孔树脂充分吸附多酚，而上样流速快时，吸附液中多酚物质未能扩散到树脂内部而被冲出柱外，导致树脂对多酚吸附率下降[16]。但0.5 mL/min和1.0 mL/min吸附率相差不大，综合时间成本考虑，选择1 mL/min作为上样流速。

2.2.4  上样溶液pH  由图5可知，AB-8大孔树脂对猴耳环多酚的吸附率随pH升高呈下降的趋势，在碱性条件下，多酚分子羟基去离子化后形成离子型结构，因此不易被吸附[17]。粗提物样品原溶液的pH为4.82，显示为弱酸性，加酸调节pH后会造成上样溶液中物质析出，堵塞大孔树脂，因此选择样品原溶液作为上样溶液。

2.2.5  洗脱液浓度  由图6结果可知，在乙醇浓度低于60%，随乙醇比例提高，解吸率提高。在乙醇浓度为60%时，得到的猴耳环多酚纯度最高，在乙醇浓度大于60%时，解吸率基本不变，同时。可能由于多酚与树脂间存在强烈的氨键作用，吸附于树脂上的多酚不易被水和低浓度的乙醇洗脱下来[18]。而过高的乙醇浓度，可能导致其他的杂质的洗脱，多酚的纯度有所降低。因此选择60%乙醇作为洗脱液。

2.2.6  洗脱流速  由图7可知，当流速大于1 mL/min，随着洗脱流速的增大，解吸率出现下降趋势，由于洗脱流速过快，洗脱液与多酚接触时间太短，解吸不充分。而在小于1 mL/min时解析率略有降低，由于在流速过低时多酚的再吸附增加。因此洗脱流速选择1 mL/min。

2.2.7  洗脱剂量  由图8可知，洗脱液多酚浓度随洗脱剂增加呈先上升后下降趋势，当洗脱量达到5 BV时，洗脱流出液中多酚含量较低，说明猴耳环多酚基本被洗脱，因此确定洗脱剂量为5 BV。

2.3  纯化工艺验证

结果见表1得出猴耳环粗提物纯度平均为37.65%，纯化后猴耳环多酚的纯度平均为58.64%，多酚的纯度提高1.5倍，可以作为多酚活性部位。说明AB-8大孔树脂对猴耳环多酚的纯化效果良好。

2.4  猴耳环多酚的组分定性分析

在负离子模式下，多酚類化合物的分离度与离子化效果均较好。结合正离子模式条件下的总离子流，根据UPLC-Q-TOF-MS矩阵中的保留时间、质荷比及碎片离子等信息并参考文献[19-21]对猴耳环多酚的成分进行分析和指认。共推测出14个多酚化合物，总离子流图见图9，数据归属详见表2，以推断得到的化合物结构与质谱离子峰见图10。

猴耳环多酚在负离子模式下，容易形成[M-H]?的准分子离子峰信号，正离子模式下形成[M+H]+、[2M+H]+、[2M+NH4]+等离子信号，故总结部分质谱图如图10所示，对其推断过程如下：

酚酸类：峰6在负离子模式中形成197[M-H]-（图10 D）准分子离子信号，在正离子模式下有199 [M+H]+、216[M+NH4]+、414[2M+NH4]+峰。因此推断其为没食子酸乙酯。

黄酮类：峰9负离子模式中形成463[M-H]?（图10G）准分子离子信号，正离子模式下形成465 [M+H]+峰，结合文献推断其为杨梅苷。峰11在负离子模式中形成447[M-H]?（图10 I）准分子离子信号，正离子模式下形成449 [M+H]+峰以及失去一个葡萄糖基的303 [M-146]+，因此推断其为槲皮苷。

黄烷类：峰1和峰3在正离子模式下形成307 [M+H]+、640[2M+NH4]+峰（图10 A），负离子模式形成305[M-H]?，因此推断其为同分异构体，而由于羟基的位置不同造成出峰时间的差异。峰4在负离子模式下形成289[M-H]?准分子离子信号，而在正离子模式下形成291[M+H]+、581[2M+H]+峰（图10 B），结合文献推断其为儿茶素。峰5和峰8在负离子模式形成457[M-H]-（图10 C、F），在正离子模式形成459 [M+H]+、934[2M+NH4]+和307 [M-152]+，推测其没食子酸酯基断裂形成。结合出峰时间，推断其分别为3位和7位的没食子酸酯结构。峰7和峰10在负离子模式中形成441[M-H]?准分子离子信号，以及884[2M-H]?。在正离子模式下形成443[M+H]+以及307[M-152]+为没食子酸酯基断裂形成。与峰5、8的规律相似，推断其为儿茶素的没食子酸酯以及5，3，4，5-tetrahydroxyflavan-7-gallat结构。峰11、峰13和峰14在负离子模式中均形成593 [M-H]?准分子离子信号。而在正离子模式下形成595[M+H]+峰。目前文献报道有7，4-di-O-galloy lt r i cetiflavan、7，3-di-O-galloyl- tricetiflavan 2种，而本研究中发现了3个分子量为594的化合物，因此推测其还存在没食子酸酯基或羟基位置差异的同分异构体，因极性不同，洗脱出峰时间不同。

3  讨论

福林酚法操作简便、精密度较高、重现性好，因此使用福林酚法进行多酚的含量测定，本课题组前期利用波长扫描确定最大吸收波长，并通过方法学考察，建立了猴耳环多酚的含量测定方法。多酚纯化多采用大孔吸附树脂法、聚酰胺法和液相色谱法等[22]。本研究比较了大孔树脂、聚酰胺和二者联用的纯化方法，发现聚酰胺法因其吸附性过强，产率低，且制备的猴耳环多酚纯度与大孔树脂法制得相近，二者联用法制备的猴耳环多酚仅略有提高，因此建立了大孔树脂纯化工艺。

在前期猴耳环特征图谱研究中，在PDA检测器摸索建立了色谱条件，分离度较好，因此用于液质组分分析研究。猴耳环多酚的成分推断中发现猴耳环多酚除没食子酸乙酯外的化合物成分具有相似结构骨架，在黄酮化合物中存在杨梅苷和槲皮苷。黄烷类结构多为羟基位置与个数或与没食子酸形成酯的羟基位置的差异。

综上所述，本研究建立并优化了猴耳环多酚纯化工艺，纯化后猴耳环多酚纯度达58.64%，初步推断主要包含槲皮苷、杨梅苷、没食子酸乙酯以及9个为黄烷类物质成分与2个新的未知成分。目前国内外对于猴耳环的单体成分的分离以及活性机理的研究较多，而对猴耳环多酚部位的总体研究报道较少，因此有必要对猴耳环多酚的提取纯化、质量标准以及活性机理进一步深入研究。

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责任编辑：崔丽虹