芳香烃受体抑制miR-101a介导PM2.5有机提取物所致斑马鱼胚胎心脏畸形

蔡畅，黄玉洁，陶怡舟，陈涛，姜岩

苏州大学医学部a.公共卫生学院 b.基础医学与生命科学学院，江苏 苏州 215123

先天性心脏病是最为常见的出生缺陷之一，发病率为0.6%～1%，如不及时治疗，约有1/3 的患者会在出生后1年内死亡。先天性心脏病的病因尚不明确，研究表明环境因素起重要作用［1］。大气污染是目前我国面临的最为严峻的环境问题，其中大气细颗粒物（PM2.5）指粒径小于2.5 µm 的颗粒物，是空气质量的重要指标［2］。PM2.5由于比表面积大，可携带多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbon，PAH）等大量有害物质，能直接进入循环系统，并透过血胎屏障，影响胎儿发育［2-3］。多项流行病学研究表明，PM2.5与先天性心脏病密切相关［4-5］，动物实验也发现，PM2.5引起斑马鱼［6］和小鼠［7］胚胎心脏发育异常。鉴于苯并芘等PAH物质的心脏致畸性，有理由认为PM2.5有机组分中的PAH在心脏发育毒性中起重要作用［8-9］。

芳香烃受体（aryl hydrocarbon receptor，AhR）是属于碱性螺旋-环-螺旋蛋白超家族的转录因子，结合二噁英或PAH 配体后可以从细胞质转运入细胞核中，与芳香烃受体核转位蛋白形成异二聚体，调控下游靶基因表达［10-11］。城市大气PM2.5有机提取物（extractable organic matter，EOM）中富含苯并芘等PAH 类物质。本课题组先前的研究表明，在斑马鱼胚胎和小鼠畸胎瘤细胞P19 中EOM 能激活AhR 信号通路，进而引起心脏畸形和心肌细胞分化异常［12-14］，但分子机制有待进一步阐明。

小分子核糖核酸（microRNAs，miRNAs）是一类小非编码RNA，在基因表达的转录后调控中发挥重要作用［15］。miRNAs 参与调节众多生物学过程，如细胞分化、凋亡和增殖等，在心脏发育中起重要作用，而miRNAs 的异常表达与心肌细胞的异常分化和功能障碍有关［16-17］。研究表明多个miRNAs 表达可受AhR 调控［18］，PM2.5染毒的斑马鱼胚胎中也发现多个miRNAs表达异常，其中miR-101a的表达降低最为显著［19］。为此，本研究检测PM2.5中EOM 染毒斑马鱼胚胎心脏中miR-101a 的表达变化及AhR 对其的调控，进一步探讨miR-101a 可能通过哪些靶基因介导PM2.5的心脏发育毒性。

1 对象与方法

1.1 主要试剂、试剂盒与仪器

二氯甲烷及DMSO等主要试剂均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。AhR小分子抑制剂CH223191（CH，CAS 301326-22-7）购于美国MedChemExpress 公司。台式高速冷冻离心机（德国Eppenford 公司），NanoDrop ND-2000 分光光度计（美国Thermo 公司），体式显微镜（加拿大Optech公司）。

1.2 收集PM2.5及提取EOM

苏州市区PM2.5采集于2015年8月1—7日，EOM提取分析的具体过程见课题组之前报道［12］。为除去膜内有机物污染，先在马弗炉中将47 mm 石英膜500℃烘烤2 h。然后将石英膜置于天虹TH-150C PM2.5采样器（中国武汉天虹仪表有限责任公司）中进行24 h 不间断采样。干燥24 h 后以分析天平定量。以索氏提取法用二氯甲烷为溶剂提取EOM，用旋转蒸发仪和氮吹仪浓缩吹干后溶解于DMSO 中并在-20℃保存。EOM 中可检测到10 种美国环保署认定的优先控制PAH，总质量浓度为178.25 ng·m-3，其中苯并芘质量浓度为24.64 ng·m-3，具体见本课题组之前的报道［12］。

1.3 斑马鱼胚胎染毒

野生（AB品系）斑马鱼购自中国斑马鱼资源中心，按照1：1 雌雄比例将野生型斑马鱼成鱼饲养在循环水产养殖系统中，水温（28±0.5）°C，光照周期14 h，黑暗周期10 h。将收集的斑马鱼胚胎按每组100 个随机分至各玻璃培养皿中，于受精后2 h（hours postfertilization，hpf）内按具体组别加入5 mg·L-1EOM 及/或0.05 µmol·L-1AhR小分子抑制剂CH进行染毒处理（EOM 和CH 浓度选择参见本实验室前期已发表的文章，均对心脏畸形有明显效应且对胚胎存活的影响没有统计学意义［12］）。根据设置的不同组别补充CH，以DMSO 为阴性照。保持各组中DMSO 体积分数不大于0.1%（此体积分数下DMSO 对胚胎发育的影响没有统计学意义［12］）。之后将培养皿放置在恒温培养箱中，温度（28±0.5）℃，14 h 光照、10 h 黑暗，使胚胎继续发育。每隔24 h 定时更换斑马鱼胚胎系统培养水，并重新加入各种药物进行染毒处理。收集72 hpf 期胚胎在解剖镜下检测存活、心脏畸形，并剖取各组斑马鱼胚胎心脏。本实验中所有动物程序均已通过苏州大学伦理委员会动物护理机构的审查及批准（无编号）。

1.4 反义吗啉寡核苷酸（morpholino，MO）及miR-101a类似物（agomir，Ago）注射

用微型注射器（Applied Scientific Instrumentation MPPI-3，Eugene，美国）将MO（用于AhR基因敲减）和Ago（用于miR-101a 过表达）注射入1～2 个细胞阶段的斑马鱼胚胎内。ahr2（5’-TGTACCGATACCCGCCGA CATGGTT-3’）由美国Gene Tools 公司合成。miR-101a类似物（5’-UACAGUACUGUGAUAACUGAAG-3’和5’-UCAGUUAUCACAGUACUGUAUU-3’）及非特异对照miRNA 类似物（5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’和5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’）由中国吉玛基因公司合成。

1.5 实时荧光定量PCR检测miRNA及mRNA 表达

每组取100 个左右72 hpf 斑马鱼胚胎心脏混合后，以TRNzol-A+总RNA 提取试剂盒（中国天根公司）提取总RNA，用NanoDrop ND-2000 分光光度计检测所提取的RNA 纯度和浓度。分别用一步法miRNA 反转录试剂盒（中国HaiGene 公司）和RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis 试剂盒（美国Thermo 公司）进行miRNA 和mRNA 的反转录。在ABI QuantStudio 6 实时荧光定量PCR 仪（美国Thermo 公司）上，使用FS Universal SYBR Green Master mix（诺唯赞，中国）进行实时荧光定量PCR。采用U6 为miRNA 表达对照，gapdh和elfa为mRNA 表达对照，以2-ΔΔCt方法计算相对表达量。引物序列见表1。

表1 实时荧光定量PCR中使用的基因引物序列Table 1 Sequences of primers used in qPCR

1.6 miRNA靶基因预测

以在线数据库Targetscan 进行斑马鱼miRNA 靶基因预测，并以DAVID 数据库对靶基因进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。

1.7 统计学分析

采用SPSS 22.0 软件，以one-way ANOVA 加Turkey 事后检验方法进行多组统计分析。所有结果以均数±标准误表示。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 PM2.5 中EOM通过AhR降低斑马鱼胚胎心脏中miR-101a表达

以5 mg·L-1EOM 染毒斑马鱼胚胎，发现心脏中miR-101a的表达下降至对照组的60%左右（P< 0.05），而AhR小分子抑制剂CH（0.05 µmol·L-1）可拮抗EOM所致的miR-101a表达下降（P< 0.05）。进一步以AhR特异性的MO敲减AhR，发现敲减AhR同样拮抗EOM引起的miR-101a表达降低（P< 0.05）。此外，敲减AhR本身增加了斑马鱼胚胎心脏中miR-101a 的表达（1.5 倍左右，P< 0.05）（图1）。

图1 受精后72 h斑马鱼胚胎中抑制AhR 可拮抗EOM所致miR-101a表达降低Figure 1 EOM-induced decrease of miR-101a expression attenuated by AhR inhibition in zebrafish embryos at 72 hpf

2.2 miR-101a 类似物减轻PM2.5中EOM引起的斑马鱼胚胎心脏畸形

EOM 组中观察到的心脏畸形主要有心包水肿和心脏线性化等（图2A），EOM 提高了斑马鱼胚胎心脏畸形率（由5%升至18%左右，P< 0.05）（图2B）。miR-101a类似物抑制EOM引起的心脏畸形率升高（由19%降至11%左右，P< 0.05），但仍高于DMSO 对照组（图2B）。

图2 受精后72 h 斑马鱼胚胎的心脏畸形Figure 2 Heart malformation of zebrafish embryos at 72 hpf

2.3 miR-101a介导PM2.5中EOM对心脏发育关键基因的调控

对miR-101a 的靶基因预测结果进行KEGG 分析，发现FoxO 及Wnt 等信号通路富集，表2 列出了部分富集程度高的信号通路。进一步检测了Wnt 通路基因gsk3β及Rho 家族小分子鸟苷酸三磷酸酶cdc42的表达。如图3 所示，EOM 引起斑马鱼胚胎心脏中gsk3βmRNA 表达升高约1.9 倍（P< 0.01），cdc42mRNA 表达升高约1.7 倍（P< 0.01），而注射miR-101a 类似物具有拮抗作用（P< 0.01）。

表2 miR-101a靶基因预测结果KEGG分析（n=556）Table 2 KEGG analysis of predicted miR-101a target genes (n=556)

图3 受精后72 h斑马鱼胚胎心脏中miR-101a对Wnt通路基因mRNA 表达的影响Figure 3 Effects of miR-101a on mRNA expression of genes involved in Wnt signaling pathway in zebrafish embryonic heart at 72 hpf

3 讨论

miRNA 在心脏发育中起关键调控作用，环境化学物可以通过miRNA 的异常表达导致心脏畸形［1］。本课题组之前报道了三氯乙烯引起斑马鱼胚胎心脏中miR-133a表达降低，导致心脏发育异常［20］。近期有研究发现PM2.5染毒的斑马鱼胚胎中也发现多个miRNA表达异常，其中miR-101a 的表达降低最为显著［19］。miR-101a在心脏的纤维化中起着不可或缺的作用［17］，其过表达可抑制AMI大鼠心肌细胞凋亡［21］。由于之前的研究仅检测整体胚胎的miRNA表达变化［19］，本研究中剖取斑马鱼胚胎心脏并提取总RNA，检测miR-101a在心脏中的特异表达。本研究发现PM2.5中的EOM 引起斑马鱼胚胎心脏畸形，同时抑制miR-101a 在心脏中的表达，这与整体胚胎中的结果一致［19］。进一步发现miR-101a 类似物拮抗EOM 所致的心脏畸形，表明miR-101a 的异常低表达在EOM 的斑马鱼胚胎心脏发育毒性中起重要作用。

城市PM2.5的EOM 中富含苯并芘等PAH 类物质，能有效激活AhR［22］。激活的AhR 可作为转录因子调控miRNA 表达，如小鼠肺组织中AhR 受香烟烟雾激活后调控多个miRNA 表达，导致氧化应激和细胞凋亡［23］。本研究通过添加AhR 小分子抑制剂和AhR 基因敲减，表明PM2.5中EOM 对miR-101a 的表达调控受AhR 介导；下一步研究将用双荧光报告酶系统验证miR-101a是否为AhR 的直接靶基因。

Wnt 通路是心肌细胞分化的关键信号通路。本课题组之前的研究报道了大气PM2.5激活AhR 后抑制Wnt 通路，导致斑马鱼胚胎心脏发育的关键基因表达异常［12］，但PM2.5激活AhR后对Wnt通路的具体调控机制尚不明确。本研究发现miR-101a的预测靶基因中有包括gsk3β在内的多个Wnt通路基因，同时miR-101a类似物拮抗PM2.5中EOM 引起的gsk3β表达异常。因此，PM2.5中EOM 激活AhR 后，可能通过miR-101a 干扰Wnt通路基因表达。

cdc42 是目前被了解的最为清楚的一种Rho 家族小分子鸟苷酸三磷酸酶，对心脏发育过程中心肌细胞增殖及细胞间黏附有重要作用［24］。本研究结果表明PM2.5中EOM 可能通过miR-101a 引起cdc42的异常表达，导致心脏发育异常。miR-101a 靶基因预测还发现FoxO 及MAPK 等信号通路，它们在心脏发育中也有重要作用，是下一步研究的重点。

本研究中斑马鱼胚胎心脏畸形率等统计虽有一定人为偏倚及随机误差，但每次样本量一般超过100，有3 次以上独立重复，且心脏畸形有两人共同认定，这些都减少了偏差。对于基因表达检测，由于是每组大约100 个胚胎的混合后提取总RNA，这增加了研究的可重复性。

总之，本研究表明在斑马鱼胚胎中PM2.5中EOM激活AhR 后抑制miR-101a 表达，干扰Wnt 信号通路，从而导致心脏发育异常。下一步研究将验证AhR 对miR-101a的具体抑制机制， miR-101a是否直接调控gsk3β等Wnt通路基因表达，以及FoxO等信号通路的作用。