基于Box⁃Behnken 响应面法优化莱菔子炒制工艺及对离体十二指肠运动的影响

庞荔丹魏娇娇苗 壮王安君吴家劲薛明真朱立俏

（山东中医药大学药学院，山东 济南250355）

莱菔子为十字花科植物萝卜Raphanus sativusL.的干燥成熟种子。具有消食除胀、降气化痰之功效，常用于治疗饮食停滞、脘腹胀满、大便秘结、痰壅喘咳等症［1］。传统中药炮制理论认为莱菔子炮制具有“生熟异治，生升熟降”的药性变化特点，生品主升，长于涌入风痰，炒品主降，长于消食除胀、降气化痰［2］。目前临床均以炒莱菔子入药。现代研究表明，莱菔子可用于治疗高血压［3］、癌 症［4］、消化不 良［5］、降血脂［6］、降 血糖［7］等疾病，主要含有硫苷类［8⁃9］、芥子酸及其寡糖酯［10⁃11］、芥子碱硫氰酸盐［12］等成分，其中硫苷类成分为其炮制前后的特征性成分，萝卜苷（glu⁃coraphenin，GRE）是其含量最高的硫苷类成分［13］，通过前期研究发现还含有另一硫苷类成分，暂定名为RS01。而炮制前后芥子碱硫氰酸盐（si⁃napine thiocyanate，ST）的含量 未发生 明显变化［14］。目前莱菔子均以ST 为指标成分进行提取、炮制及质量控制研究，指标成分缺乏专属性。另外莱菔子炮制工艺参数多适用于小量锅炒的规模［15］，与炒药机工业化炒制的参数偏差较大。基于此，本实验以优化莱菔子炒药机炒制工艺为目标，采用Box⁃Behnken 响应面法，以GRE、RS01 和ST 多指标量化莱菔子的最佳炒制工艺，以期为规范莱菔子的炮制工艺和工业化大生产提供科学依据，保证临床用药的安全性和有效性。

1 材料

Agilent1260 高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；MK⁃30 型炒药机（江阴市祝塘明科机械厂）；EX225ZH／AD 型电子分析天平（十万分之一，常州奥豪斯仪器有限公司）；KQ5200 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；MP160 多道生理记录仪（美国Biopac 公司）；HW200s 恒温平滑肌实验系统（成都泰盟软件有限公司）；FLBP⁃200型万能高速粉碎机（上海菲力博食品机械有限公司）；GFL⁃230 电热鼓风干燥箱（天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司）。萝卜苷对照品（纯度≥98%，美国Cayman 公司，批号0453522⁃24）；芥子碱硫氰酸盐对照品（纯度≥98%，成都德思特生物技术有限公司，批号DST160910⁃021）。乙腈、甲醇（色谱纯，美国TEDIA 公司）；水为娃哈哈饮用纯净水；其余试剂为分析纯。

生莱菔子饮片（生产批号181101），购于山东百味堂中药饮片有限公司，经山东中医药大学药学院张芳副教授鉴定为十字花科植物萝卜RaphanussativusL.的干燥成熟种子。

雄性健康SD 大鼠，体质量（200～220）g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，合格证号SCXK（鲁）20140007。

2 方法与结果

2.1 萝卜苷、芥子碱硫氰酸盐、RS01 含量测定

2.1.1 色谱条件 Inertsil ODS⁃3 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）⁃0.1% 磷酸（B），梯度洗脱（0～15 min，5%～10% A；15～17 min，10%～12.5% A；17～27 min，12.5%～14% A；27～55 min，14%～25% A；55～57 min，25%～70% A；57～70 min，70%～100% A；70～80 min，100% A）；体积流量1.0 mL／min；柱温30 ℃；检测波长225、326 nm；进样量10 μL。

2.1.2 对照品溶液制备 精密称取干燥至恒定质量的萝卜苷对照品12.70 mg、芥子碱硫氰酸盐对照品10.75 mg，分别置于25 mL 量瓶中，用纯净水将萝卜苷溶解后定容至刻度，制成0.508 mg／mL对照品溶液，备用；用50% 甲醇将芥子碱硫氰酸盐溶解后定容至刻度，制成0.43 mg／mL 对照品溶液，备用。

2.1.3 供试品溶液制备 取炒莱菔子适量，粉碎，过40 目筛，精密称取粉末约2 g，置于100 mL 具塞锥形瓶中，精密加入蒸馏水25 mL 浸泡30 min后，再精密加入甲醇25 mL，称定质量，超声30 min，静置，冷却至室温，补足减失质量，滤过，取续滤液，0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.1.4 线性关系考察 精密吸取“2.1.2”项下萝卜苷对照品溶液1、2、5、10、20、50、80 μL，芥子碱硫氰酸盐对照品溶液1、2、5、8、10、15 μL，在“2.1.1”项色谱条件下进样10 μL。以峰面积为纵坐标（Y），进样量为横坐标（X）进行回归，得萝卜苷、芥子碱硫氰酸盐回归方程分别为Y＝679.1X＋36.36（r＝0.999 8）、Y＝2 826X＋38.83（r＝0.999 8），分别在0.508～40.64、0.43～6.45 μg 范围内线性关系良好。

2.1.5 系统适应性和专属性试验 精密吸取对照品、供试品溶液各10 μL，在“2.1.1”项色谱条件下进样。结果，萝卜苷、芥子碱硫氰酸盐的保留时间分别为5.331、26.027 min，RS01 保留时间为49.093 min，分离度良好。色谱图见图1。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.1.6 精密度试验 取“2.1.2”项下对照品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样6 次，测得萝卜苷峰面积RSD 为0.63%，芥子碱硫氰酸盐峰面积RSD 为0.84%，RS01 峰面积RSD 为0.74%，表明仪器精密度较好。

2.1.7 重复性试验 取同一炮制条件下的炒莱菔子粉末，按“2.1.3”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下分别进样10 μL，测得萝卜苷峰面积RSD 为1.53%，芥子碱硫氰酸盐峰面积RSD 为1.84%，RS01 峰面积RSD为1.69%，表明该方法重复性良好。

2.1.8 稳定性试验 取“2.1.3”项下供试品溶液，于0、2、4、6、8、10、12 h 在“2.1.1”项色谱条件下进样，测得萝卜苷峰面积RSD 为0.89%，芥子碱硫氰酸盐峰面积RSD 为1.29%，RS01 峰面积RSD 为1.56%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.1.9 加样回收率试验 精密量取“2.1.3”项下供试品溶液6 份，精密加入萝卜苷、芥子碱硫氰酸盐对照品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下各进样10 μL测定，测得萝卜苷、芥子碱硫氰酸盐平均加样回收率分别为98.92%、99.44%，RSD 分别为0.92%、2.35%。

2.1.10 RS01 含量变化表示 RS01 在炮制条件改变后，根据HPLC 数据分析可知其含量会发生明显的变化，是具有显著性的评价指标，但由于缺乏对照品，无法采用标准曲线法进行含量测定。因此，本实验以RS01 峰面积与所对应饮片质量的比值表示其相对含量。

2.1.11 综合得分评价指标 参考文献［16］，以萝卜苷、芥子碱硫氰酸盐和RS01 为指标成分，采用Box⁃Behnken 响应面法进行多指标综合评价，综合得分（Z）＝萝卜苷得分×40%＋芥子碱硫氰酸盐得分×40%＋RS01 得分×20%、指标成分得分（S）＝该指标成分含量／该指标成分所在组中含量的最高值。本实验单因素考察和响应面分析均以综合评分为主，各指标得分为辅进行分析。

2.2 单因素试验

2.2.1 炒制温度 将炒药机转速设置为30 r／min，预热30 min，取生莱菔子饮片约100 g，置于炒药机中，分别于180、200、220、240、260 ℃炒制3 min，取出放凉，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1”项条件下进样，按“2.1.11”项下方法进行指标得分和综合得分的计算。结果见表1。

表1 不同炒制温度下指标成分的指标得分和综合评分（n＝3）Tab.1 Index scores and comprehensive scores of index components at different processing temperatures（n＝3）

由表1 可知，3 种指标成分均在炮制温度200 ℃时出现最高值，但芥子碱硫氰酸盐含量在各温度下差别不大，同时以综合评分也在200 ℃时得分最高。因此，选取180、200、220 ℃3 个水平进行响应面优化。

2.2.2 炒制时间 将炒药机转速设置为30 r／min，预热30 min，称取生莱菔子饮片100 g，置于炒药机中，于200 ℃下分别炒制1、3、5、7 min，取出放凉，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，进行HPLC 含量测定和指标得分、综合得分的计算。结果见表2。

表2 不同炒制时间下指标成分的指标得分和综合评分Tab.2 Index scores and comprehensive scores of index components under different processing time

由表2 可知，萝卜苷、芥子碱硫氰酸盐硫氰酸盐含量均在炒制时间为3 min 时出现最高值，RS01含量在1 min 时出现了最高值，但3 min 时与最高值十分接近。根据指标得分为辅，综合得分为主的分析，选取2、3、4 min 3 个水平进行响应面优化。

2.2.3 炒药机转速 将炒药机温度设置为200 ℃，预热30 min，称取生莱菔子饮片100 g，置于炒药机中，分别于转速20、30、40 r／min 下炒制3 min，取出放冷，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，进行HPLC 测定和得分计算。结果见表3。

表3 炒药机不同转速下指标成分的指标得分和综合评分Tab.3 Index scores and comprehensive scores of index components at different processing speed

由表3 可知，萝卜苷、芥子碱硫氰酸盐含量均在30 r／min 出现最高值，RS01 含量在20 r／min 出现最高值，综合评分以炒制30 r／min 得分最高。因此，选取20、30、40 r／min 3 个水平进行响应面优化。

2.3 响应面优化实验

2.3.1 响应面法实验设计及结果 在单因素试验的基础上，以炒制温度（A）、炒制时间（B）和炒药机转速（C）作为考察因素，萝卜苷、芥子碱硫氰酸盐、RS01 的指标得分（S）和综合得分（Z）作为响应值，设计3 因素3 水平方案，采用Box⁃Behnken 中心组合设计原理，经Design⁃Expert V8.0.6 软件处理，得到3 因素3 水平共17 组试验，结果见表4。

表4 莱菔子炒制工艺的响应面优化结果Tab.4 Results of response surface optimization for stir⁃frying process of R.sativus

2.3.2 方差分析 应用Design⁃Expert.V8.0.6 软件进行分析，得到多元二次回归模拟方程为Z＝－7.805 18＋0.071 495A＋0.980 42B－0.028 88C－3.310 53×10－3AB＋1.571 15×10－4AC＋3.278 48×10－3BC－1.521 31×10－4A2－0.058 818B2－2.393 56×10－4C2，方差分析见表5。方程决定系数R2＝0.960 0，校正决定系数＝0.908 6，表明该模型的拟合程度较好；F＝18.67，P＝0.000 4 ＜0.01，表明回归方程具有统计学差异；变异系数（CV%）为3.82%，方程的离散程度较小，且F失拟＝2.04，P＝0.250 5＞0.05，表明方程的失拟程度不具有统计学差异，可用于优选莱菔子炒制工艺。另外，一次项A、B、C、二次项A2、B2和两两交互项AB对于回归模型具有显著性影响，而3 个单因素指标对于响应面回归模型的影响程度依次为A＞B＞C。

表5 方差分析Tab.5 Analysis of variance

2.3.3 响应面3D 图分析 按“2.3.2”项下得到的回归方程，利用Design⁃Expert.V8.0.6 软件进行莱菔子炒制条件的优选，响应面分析见图2。根据所得的3D 图，可通过观察响应曲面的倾斜度来确定2 个指标对于响应值Z的影响程度，倾斜度越大，则影响程度越高，同时3D 图的颜色变化和等高线形状也可作为判断曲面倾斜度大小的指标，颜色越深则提取出的含量越多，坡度越大，对响应值的影响越显著，等高线最小椭圆的中心点即为响应值最高点，椭圆形则表示两因素交互作用明显，而圆形则反之。因此，可以得出A与B、C的相互作用明显，A对于Z的影响程度最大的结论。

图2 炒制温度、炒制时间和炒药机转速间的交互作用Fig.2 Interactions among stir⁃frying temperature，stir⁃frying time and rotation speed of herbal medicine roaster

以综合评分作为响应值并结合单因素考察方法，优选出的莱菔子炒制条件为炒制温度217.09 ℃，炒制时 间 3.05 min，炒制转 速29.73 r／min。考虑到实际应用中的可行性，最终确定为炒制温度220 ℃，炒制时间3 min，炒制转速30 r／min。

2.3.4 验证试验 取1 kg 生莱菔子饮片，共10份，按照响应面法优选出的炮制工艺，在200 ℃、2 min、40 r／min，200 ℃、3 min、30 r／min，220 ℃、3 min、30 r／min，220 ℃、3 min、20 r／min，240 ℃、3 min、30 r／min 5 种炮制条件下制备炒莱菔子饮片，每个条件平行制备2 份，结果见表6。由此可知，响应面优选的最佳炮制工艺的平均综合得分为0.990 75，与回归方程的拟合值1.038 342 761 接近，相对误差均小于5%，2 组平行样品的RSD＜3%，表明精密度较好；与相近几组炮制工艺的数据相比，响应面优化出的炮制工艺3 个指标的得分和综合得分均最好，表明响应面模型和回归方程具有良好的预测性，所优选出的莱菔子炮制工艺可行性高，对相关后续研究具有指导意义。

表6 验证试验结果Tab.6 Results of verification tests

2.4 炒莱菔子水提液对大鼠离体十二指肠运动的影响

2.4.1 炒莱菔子水提液制备 取莱菔子饮片适量，置于炒药机中，设置炒制温度220 ℃，炒药机转速30 r／min，炒制时间3 min，粉碎，加10 倍量水提取2 次，每次0.5 h，滤过，合并提取液，浓缩至质量浓度为1 g／mL，备用。

2.4.2 Kreb’s 营养液制备 称取NaCl 7.8 g、KCl 0.35 g、MgSO40.15 g、NaH2PO40.21 g、NaHCO31.37 g、CaCl211.1 g、葡萄糖1.8 g，加蒸馏水至1 L，现配现用。

2.4.3 大鼠离体十二指肠肠管制备 大鼠禁食不禁水24 h，脱颈椎处死后剖开腹部，剪取近幽门端十二指肠肠管10 cm，置于预冷的Kreb’s 液中，小心分离肠外周结缔组织，用预冷的Kreb’s 液冲洗肠内容物，剪成3 cm 长的肠段备用。将肠段置于盛有20 mL Kreb’s 液的恒温37 ℃浴槽中，持续通入5% CO2和95% O2混合气体（1～2 个气泡／s），每隔15 min 换1 次Kreb’s 液，前负荷1 g，平衡1 h，待肠管收缩稳定后进行实验［18］。分别缓慢向盛有Kreb’s 液的恒温37 ℃浴槽中加入不同剂量的炒莱菔子水提液，记录给药前后的十二指肠肠段收缩的振幅和张力，37 ℃Kreb’s 液冲洗肠段3 次，待大鼠肠段恢复正常收缩频率后，滴加下一个剂量的炒莱菔子水提液，重复上述步骤。

2.4.4 不同剂量炒莱菔子水提液对大鼠离体十二指肠运动的影响

精密吸取“2.4.1”项下炒莱菔子水提液600 μL，缓慢加入肠管已平衡好的37 ℃恒温浴槽中，记录加药前后肠管变化，按“2.4.3”项下方法依次加入800、1 000、1 200 μL 水提液，观察离体十二指肠肠管收缩振幅和张力变化。

采用SPSS 17.0 软件对不同莱菔子样品给药前后数据结果进行单因素方差分析，Graphpad Prism 8.0.1 软件将数据处理成柱状图的形式，结果见图3。

图3 炒莱菔子水提液对大鼠离体十二指肠张力和振幅的影响Fig.3 Effect of aqueous extract of stir⁃fried R.sativus on the tension and amplitude of rats ’isolated duodenum

由此可知，炒莱菔子水提取液在质量浓度为0.03～0.06 mg／mL 时可增大肠收缩的振幅（P＜0.05，P＜0.01），在质量浓度为0.04～0.06 mg／mL时可使肠运动振幅增大（P＜0.05，P＜0.01），表明炒莱菔子水提液具有促进离体十二指肠运动的作用。

3 讨论

中药炮制直接影响临床疗效，明代《本草蒙筌》 中讲到“凡药制造，贵在适中，不及则功效难求，太过则气味反失［17］”。由单因素考察结果表明，炒制温度对莱菔子中萝卜苷和RS01 含量影响较大，生莱菔子中萝卜苷会发生酶解反应［13］，莱菔子炒制太过检测不到萝卜苷［18］，但炒制温度对RS01 的报道尚未发现。由此可见萝卜苷和RS01 含量的高低是反映炒莱菔子质量的重要专属性指标。因此采用专属性的多指标评价方法优化莱菔子的炒制工艺，可更全面专属的反映莱菔子炒制程度对其质量的影响，确定莱菔子炒制中的“火候”要求。

传统炮制理论认为莱菔子炒制具有“生熟异治、生升熟降”的药性变化特点，莱菔子炒制性转沉降，具有消食除胀、降气化痰之功效，在临床中作为常用消食药。但其消食除胀的物质基础和药理作用机制并不明确，因此基于上述实验推测萝卜苷和RS01 可能为莱菔子炒制“生熟异治”的物质基础。炒制得当的炒莱菔子可具有促进大鼠离体十二指肠运动。

根据各指标响应值的回归模型进行分析，萝卜苷＝－13.131 33＋0.109 51A＋2.101 44B－0.073 168C－7.188 75×10－3AB＋3.363 75×10－4AC＋0.010 850BC－2.206 37×10－4A2－0.138 13B2－5.843 00×10－4C2，F＝17.79，P＝0.000 5＜0.05，模型回归显著。模型决定系数R2＝0.958 1，Radj2 ＝0.904 2，CV ＝8.78%，表明方程拟合度好，而F失拟＝22.25，P＝0.005 9＜0.05，失拟性显著，表明仅以萝卜苷作为指标，不适合进行响应面设计；芥子碱硫氰酸盐＝－3.322 67 ＋0.038 021A＋0.191 79B－3.256 25×10－3C－4.950 00×10－4AB＋3.325 00×10－5AC－1.557 50×10－3BC－8.803 12×10－5A2－7.637 50×10－3B2＋4.012 50×10－5C2，F＝7.80，P＝0.006 5 ＜0.05，表明二次多元回归方程的模型显著，模型决定系数R2＝0.909 3，Radj2＝0.792 7，CV ＝2.00%，表明方 程的拟 合度较 好；RS01 ＝＋0.332 64＋2.917 50×10－3A－2.487 50×10－3B－4.062 50×10－4C，模型决定系数R2＝0.443 8，Radj2＝0.315 5，CV＝5.74%，表明方程的拟合度较差，F＝3.46，P＝0.048 2＞0.05，表明回归模型不显著，而且不是多元二次方程，为一次多元方程，没有交叉项的影响存在。综上所述，以评价指标的综合得分进行莱菔子炮制工艺的响应面优化具有必要的意义。