排脓散对结肠癌小鼠的抗肿瘤作用

张孟孟芮雪琳杨 晔徐 莉尹登科

（1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥230012； 2.新安医学教育部重点实验室，安徽 合肥230012；3.现代中药研究与开发安徽省重点实验室，安徽 合肥230012）

排脓散源自《金匮要略》，由枳实、芍药、桔梗3 味中药按5 ∶5 ∶2 的比例配伍组成［1］，具有排脓化毒、调理气血、止痛等功效［2⁃3］，可用于肠痈、疮痈等多种脓肿性疾病的治疗［4］。现代病理实验证明，该方对醋酸所致急性炎症小鼠模型具有明显的抗炎作用［5］，但机制仍未明确。

结肠癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，具有预后效果差、反复发作、高死亡率等特点［6⁃8］。近年来临床研究表明，炎症性肠病与结肠癌的发病率高度相关［9］，阻断结肠炎症向结肠癌演变是结肠癌二级预防的关键。本实验旨在研究排脓散对致癌剂氧化偶氮甲烷和诱导剂葡聚糖硫酸钠诱导结肠癌小鼠的抗肿瘤作用，以期为该方临床应用提供依据。

1 材料

1.1 试剂与药物 氧化偶氮甲烷（美国Sigma 公司）；葡聚糖硫酸钠（相对分子质量36 000～50 000，中国大连美伦生物科技有限公司）。阿司匹林肠溶片（中国石家庄康力药业有限公司）。枳实、白芍、桔梗由安徽合肥当地中药材市场提供，经安徽中医药大学刘守金教授鉴定为正品。IL⁃4、IFN⁃γ 兔抗鼠多克隆抗体（北京博奥森生物工程有限公司）；IL⁃6、TNF⁃α 兔抗鼠多克隆抗体（沈阳万类生物工程有限公司）。其余试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。

1.2 仪器 DM2000 荧光显微镜（德国Leica 公司）；Milli⁃Q 超纯水系统（美国Millipore 公司）。

1.3 动物 雄性Balb／c 小鼠（20±2）g，购于安徽医科大学实验动物中心，动物生产许可证号SCXK（皖）2017⁃001。实验开始前，小鼠适应性饲养1 周。

2 方法

2.1 排脓散提取物制备 称取120 g 组方药材（枳实、白芍、桔梗比例为5 ∶5 ∶2），加入10 倍量超纯水浸泡30 min，武火煮沸，文火煎煮30 min，过滤得一煎煎煮液；二煎加入8 倍量水，武火煮沸，文火煎煮25 min，过滤得二煎煎煮液，合并2 次煎煮液，浓缩至75 mL，即得，－20 ℃下保存待用。

2.2 分组与造模 32 只小鼠随机分为对照组、模型组、阳性药（阿司匹林）组、排脓散组，每组8只。其中，模型组小鼠于实验开始第1 天将腹腔注射10 mg／kg 氧化偶氮甲烷，于第8～14、29～35、50～56 天摄取含2.5%葡聚糖硫酸钠的饮用水，以建立结肠癌模型。

2.3 给药 从实验第8 天起直至造模结束，小鼠每天灌胃给药。临床上，排脓散给药剂量为12 g 生药／70 kg，阿司匹林为0.1 g／70 kg，按照小鼠给药剂量换算方法［10］，排脓散组、阳性药组小鼠给药剂量分别为1.6 g 生药／kg、13 mg／kg，而对照组、模型组灌胃给予相同容量的超纯水，每周称量体质量。给药结束后，收集小鼠结肠组织，测量长度，统计肿瘤数目，见图1。

图1 结肠癌小鼠模型建立方法Fig.1 Establishment method of colon cancer mouse model

2.4 免疫组化实验 小鼠肠组织石蜡切片后常规脱蜡，梯度乙醇脱水，PBS 缓冲液漂洗，在95 ℃10 mmol／L 枸橼酸钠溶液中修复20 min，冷却至室温，加入过氧化物酶阻断剂，室温下孵育10 min，PBS 缓冲液漂洗，加入山羊血清，37 ℃下孵育20 min，倾去血清（无需洗涤），分别滴加兔抗IL⁃4、IL⁃6、TNF⁃α、IFN⁃γ（均为1 ∶200 比例稀释），4 ℃下孵育过夜，TBST 缓冲液漂洗，滴加适量辣根酶标山羊抗兔IgG 聚合物，37 ℃下孵育30 min，TBST 缓冲液漂洗，DAB 显色1 min，盐酸乙醇分化，梯度乙醇脱水透化，中性树胶封片，在光学显微镜下观察。每张切片随机选取6 个视野（×200），采用Image⁃J 图像分析系统进行分析，记录积分光密度（IOD）值。

2.5 苏木精⁃伊红（HE）染色 小鼠肠组织石蜡切片后常规脱蜡，梯度乙醇脱水，苏木素染色3 min，流水冲洗1 min，1%盐酸乙醇分化5 s，流水冲洗1 min，返蓝，伊红染色15 s，流水冲洗1 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透化，中性树胶封片，在光学显微镜下观察。每张切片随机选取6 个视野（×200）观察。

2.6 统计学分析 通过SPSS 23.0 软件进行处理，计量资料以（）表示，2 组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 排脓散对小鼠体质量、结肠长度及肿瘤个数的影响 与对照组比较，模型组小鼠体质量降低，结肠长度缩短（P＜0.01）；与模型组比较，排脓散组小鼠肿瘤个数减少（P＜0.01），并具有抑制体质量下降趋势和结肠缩短的作用（P＜0.01），见图2。

图2 排脓散对小鼠体质量、结肠长度、肿瘤个数的影响Fig.2 Effects of Painong Powder on body weight，colon length and tumor number of mice

3.2 小鼠结肠组织病理形态 除对照组外，各组小鼠都观察到炎性细胞浸润。与对照组比较，模型组小鼠隐窝扭曲脓肿、淋巴细胞浸润严重，腺体不典型增生，并可见异样结构；阳性药组小鼠显示出炎症状态，隐窝破坏，微绒毛缺失，炎症细胞浸润，腺体排布紊乱；排脓散组小鼠显示轻微的前炎症状态，肠隐窝变浅，微绒毛数量减少并变短，见图3。

图3 各组小鼠结肠组织病理形态Fig.3 Pathological morphologies of colon tissues of mice in various groups

3.3 排脓散对小鼠结肠组织IL⁃6、TNF⁃α、IL⁃4、IFN⁃γ 蛋白表达的影响 与对照组比较，模型组小鼠结肠组织IL⁃6、TNF⁃α蛋白表达升高（P＜0.01）；与模型组比较，排脓散组小鼠结肠组织IL⁃6、TNF⁃α 蛋白表达升高降低（P＜0.01），见图4。

图4 排脓散对小鼠结肠组织IL⁃6、TNF⁃α 蛋白表达的影响Fig.4 Effects of Painong Powder on the protein expressions of IL⁃6 and TNF⁃α in colon tissues of mice

与对照组比较，模型组小鼠结肠组织IL⁃4、IFN⁃γ 蛋白表达降低（P＜0.01）；与模型组比较，排脓散组小鼠结肠组织IL⁃4、IFN⁃γ 蛋白表达升高（P＜0.01），见图5。

图5 排脓散对小鼠结肠组织IL⁃4、IFN⁃γ 蛋白表达的影响Fig.5 Effects of Painong Powder on the protein expressions of IL⁃4 and IFN⁃γ in colon tissues of mice

4 讨论

肠道的慢性炎症是结直肠癌发生的主要原因之一，因此阻止结肠炎向结肠癌的转变是防治结肠炎相关性结肠癌的一个重要手段［11］。中药复方排脓散由枳实、芍药、桔梗3 味中药组成，配比精简，广泛应用于疮痈、肠痈等症的治疗。本研究考察了排脓散对结肠炎诱导的结肠癌的治疗作用，排脓散能够显著缓解经AOM／DSS 诱导建立的小鼠结肠癌模型体质量下降趋势，并抑制结肠长度缩短和模型小鼠的结肠肿瘤生长，证实排脓散对AOM／DSS 诱导的小鼠结肠癌有明显的改善作用。

炎症因子表达失衡在结肠癌发生发展中起重要作用，通过对结肠组织进行免疫组化染色和光密度值计算发现，与对照组比较，模型组小鼠结肠组织IL⁃6 及TNF⁃α 表达水平升高，IL⁃4 及IFN⁃γ 表达水平降低；而排脓散给药组中，上述指标均出现明显逆转趋势。IL⁃6 及TNF⁃α 是肿瘤微环境中重要的促炎因子，AOM／DSS 诱导的结肠癌小鼠血清中往往IL⁃6 水平较高［11⁃13］，而TNF⁃α 可以诱导靶细胞DNA 突变、恶性转化、细胞增殖以及血管增生，同时与肿瘤细胞的浸润和转移密切相关，促进肿瘤的进展［14］。相反，炎性细胞分泌的抑炎细胞因子包括IL⁃4、IL⁃10 等则能够抑制炎症反应的发生［15］。IFN⁃γ 是具有广泛的免疫调节的淋巴因子，具有诱导机体抗病毒状态、抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡等作用［16］。因此，排脓散可能是通过改善结肠组织中促炎因子与抗炎因子的表达水平，从而抑制结肠炎小鼠炎癌转变的进程。