复合抗氧化剂处理对五香牛肉低温贮藏品质的影响

陈洪生，国 慧，刁静静，刘 欢，张根生

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学国家杂粮工程技术研究中心，黑龙江大庆 163319；3.哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江哈尔滨 150076）

五香酱牛肉是我国传统的酱卤肉制品，其风味独特、营养美味备受消费者喜爱。近年来人们对食品营养、安全需求的日益提高，对食品品质、风味、安全性的需求也日益增加。但是对于肉制品而言，在一定贮藏条件下多会因前期加工工艺或处理方法不当导致脂肪、蛋白质等成分发生氧化、制品中亚硝酸盐含量超标，甚至导致致癌物质亚硝胺的产生，这已成为传统肉制品工业化推广中亟需解决的关键技术问题。因此如何延长肉制品的货架期、提高产品贮藏期间的安全性、降低合成抗氧化剂的使用量已成为国内外肉制品研究领域研究的热点。

近年来，传统肉制品的贮藏保鲜技术已进行了广泛的研究，如杀菌、真空包装、气调包装、添加抗氧化剂或者低温贮藏等方式[1]。其中添加抗氧化剂已是肉制品中最为常见的延长货架期的方式，但是随着消费者对化学合成抗氧化剂和抗生素等产品的抵触，天然抗氧化剂越来越受到研究者的关注。常用的天然抗氧化剂包括乳酸链球菌素、丁香、迷迭香、茶多酚、溶菌酶等[2]。到目前为止，越来越多的研究证实单一的天然抗氧化剂可以较好地延长肉制品的保质期。Shahbazi等[3]用乳酸链球菌素（Nisin）处理牛肉后，生牛肉饼在贮藏期间微生物呈现下降的趋势，并且说明Nisin是食品中潜在的防腐剂和抑菌剂。Sharma等[4]研究在鸡肉香肠中添加不同浓度组合的丁香、肉桂、百里香精油后对冻藏后其产品感官及贮藏的稳定性的影响，发现丁香精油可显著降低产品的TBARS值，并且肉桂精油具有较好的抑菌特性。天然抗氧化剂乳酸链球菌素在食用后容易被消化道中蛋白酶分解为氨基酸，因此其食用安全性较高，与亚硝酸盐结合使用具有更好的效果[5]。迷迭香通过淬灭单线态氧、切断类脂物自动氧化连锁反应等发挥抗氧化作用，并且因丁香和肉桂具有较强抗氧化活性使其在肉制品防腐保鲜中应用较多。这些研究均说明天然抗氧化剂可延长肉制品的货架期，且安全性高。但是单一的天然抗氧化剂由于其抑菌成分以及对微生物的作用效果比较单一，贮藏期间的抑菌效果和品质稳定性变化较大。因此亟需探索更安全、更稳定的天然防腐剂配方。

本课题组前期的研究已发现在在肉制品体系中，单一的抗氧化剂效果没有复合抗氧化剂的效果好[6]。因此，本试验以五香牛肉为研究对象，以工业化加工过程为主线，研究不同的天然抗氧化剂对牛前腱贮藏期间安全品质的影响，以分析五香牛肉在贮藏过程中品质变化的规律，为五香牛肉的生产贮藏提供技术指导，也为复合抗氧化剂在生产中的应用提供理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牛前腱 黑龙江大庄园肉业集团有限公司；2-硫代巴比妥酸 BR，国药集团化学试剂有限公司；亚铁氰化钾、乙酸锌、无水对氨基苯磺酸 AR，沈阳市华东试剂厂；四硼酸钠 AR，天津永晟精细化工有限公司； N-1-奈乙二胺盐酸盐、亚硝酸钠 AR，辽宁泉瑞试剂有限公司；无水硫酸钠 GR，天津市科密欧化学试剂有限公司；二氯甲烷 色谱纯（HPLC），天津市大茂化学试剂厂；N-亚硝基二甲胺 标准品，美国o2si公司；乳酸链球菌素 浙江新银象生物工程有限公司；风干碎迷迭香 福克斯食品有限公司；肉桂、丁香 大庆-北京华联超市。

CR-410 色彩色差计 日本KONICA MINOLTA公司；VTS-42真空滚揉机 美国BIRO公司；SPECORD 210 plus紫外可见分光光度计 德国Analytikjena公司；肌肉pH测定仪 德国MATTHAUS公司；5810 R离心机 德国Eppendorf AG公司；GC-2010气相色谱仪 日本岛津；TTL-DCII型氮吹仪 北京同泰联科技发展有限公司；R-210旋转蒸发仪 瑞士步琪。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理 取新鲜牛前腱10 kg，盐水注射加入腌制剂（0.02%砂仁、0.06%大料、0.10%肉桂、0.10%小茴香、0.04%花椒、0.04%丁香、0.04%草果、0.03%良姜、0.04%豆蔻、0.32%蒜、0.40%葱、0.32%姜）并在真空度为68 kPa条件下进行真空间歇滚揉工艺，一个周期为工作15 min，间歇5 min，滚揉后于4 ℃左右温度下腌制24 h，取腌好后的牛肉沸水预煮9 min，预煮结束后加入五组复配的天然抗氧化剂，第一组（对照组）处理的组合为0% 乳酸链球菌素（Nisin）+0%丁香（clove）+0% 迷迭香（rosemary）+0% 肉桂（cassia），第二组处理为0.05% 乳酸链球菌素+0.05% 丁香+0.12% 肉桂，第三组处理为0.05%乳酸链球菌素（Nisin）+0.05%丁香+0.03% 迷迭香，第四组处理为0.05% 丁香+0.03% 迷迭香+0.12% 肉桂，第五组处理为0.05%乳酸链球菌素（Nisin）+0.05% 丁香+0.03% 迷迭香+0.12% 肉桂，蒸煮3.5 h，二次包装后85 ℃水浴中二次杀菌30 min。最后于低温4 ℃条件下贮藏待后续的研究试验。

1.2.2 指标测定

1.2.2.1 红度值测定 采用CR-410色彩色差计，光源为D65，对设备以白板校准后，测定肉样品至少三个位点的红色度a*（正数代表红色，负数代表绿色），该值越高说明肉颜色越好。

1.2.2.2 pH的测定 对肌肉pH测定仪设备进行校准，校准后直接插在样品中心进行测定。

1.2.2.3 TBARS的测定 参照Kang等[7]和Lynn等[8]的方法。称取0.4 g肉样，加入3 mL TBA（硫代巴比妥酸）溶液，15 mL TCA（三氯乙酸）-HCl溶液，加入0.05 mL三滴抗氧化剂（BHT），均质，沸水浴30 min，冰水冷却。取上述溶液5 mL，加5 mL氯仿，3000 r/min 下离心 10 min，取上清液 532 nm 下测吸光值。

式中，A532—溶液吸光度；m—样品质量（g）；9.48—常数。

1.2.2.4 菌落总数的测定 按照GB4789.2-2016中的方法进行测定。

1.2.2.5 TVB-N的测定 参照Zhang等[9]的测定方法。称取10 g样品放入150 mL的带塞三角瓶，加入100 mL蒸馏水，室温振摇30 min，用WhatmanⅡ号滤纸进行过滤，滤液4 ℃备用。分别取1.00 mL样液和饱和碳酸钾滴入三角瓶中，密封后将其于桌面上轻轻转动，使样液与碱液混合，然后吸取1 mL混合样液与0.05 mL混合指示液（1份甲基红乙醇溶液与5份溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合）混合，37 ℃密封反应2 h，用0.01 N盐酸标准溶液或硫酸标准溶液进行滴定，同时做试剂空白试验。记录数据。

式中，V1—样液消耗盐酸标准滴定溶液的体积（mL）；V2—试剂空白消耗盐酸标准滴定溶液的体积（mL）；0.01—盐酸标准滴定溶液的浓度（mol/L）；14—滴定1.0 mL盐酸[ c（HCL）=1.000 mol/L]标准滴定溶液相当的氮的质量（g/mol）；m—试样质量（g）。

1.2.2.6 亚硝酸盐残留量的测定 按照GB 5009.33-2016中的分光光度法测定。

1.2.2.7 感官评价 感官评定参考Zhang等[9]并作适当修改，感官评定由感官评定小组在感官评价室完成，感官评价小组由8位受过培训的人员组成。感官评价的指标包括五香牛前腱的颜色、风味、组织状态、滋气味和总体可接受性。评价指标采用7分制。1分为最低，7分为最高，总分35分。

1.3 数据处理

每个试验重复3次，结果表示为“平均数±标准差”，数据统计分析采用Statistix 8.1软件中的Linear Models程序进行，差异显著性（P<0.05）分析使用Tukey HSD程序，采用Sigmaplot 12.5 软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同抗氧化剂处理对产品贮藏期间红度值的影响

a*代表产品的鲜艳颜色，a*越大表示产品颜色越好，由表1可知，贮藏期间产品的红度值（a*）呈现下降的趋势，对照组处理1第0 d其a*为17.16与处理2（17.22）、处理3（17.07）、处理4（16.11）差异不显著（P>0.05），但是显著小于处理5的a*19.79（P<0.05），贮藏第60 d处理1的a*为11.65，显著低于处理2（14.32）和处理5（14.51）的a*（P<0.05）。贮藏进行过程中肌内膜上脂肪氧化形成的羰基可以与肌肉蛋白褐色色素中的自由基发生反应，加速褐色素物质的形成，进而造成肌肉的a*下降[10]。处理5的五香牛肉产品在0～30 d内其a*下降不显著（P>0.05），贮藏45 d时开始发生显著变化（P<0.05），其效果优于其他四个处理组，这可能是由于复合天然抗氧化剂乳酸链球菌素、丁香、迷迭香、肉桂协同发挥了保鲜作用。Huang等[11]发现添加肉桂后的猪肉糜在4 ℃贮藏下，脂肪氧化变慢其颜色的劣变程度也变缓。产品贮藏过程中微生物的生长消耗五香牛肉中残留的氧气，会促进高铁肌红蛋白(Metmyoglobin，MetMb) 的形成[12]。而此时复合添加剂中的乳酸链球菌素可利用离子间的相互作用及其分子的C末端、N末端对微生物细胞膜结构产生作用，导致细胞内物质泄漏，导致细胞解体死亡，减慢由此造成的肉颜色下降等不良现象。

表1 不同抗氧化剂处理对牛肉贮藏期间红度值的影响Table 1 Effect of different antioxidant treatment on a* of beef during storage

表2 不同抗氧化剂处理对牛肉贮藏期间pH的影响Table 2 Effect of different antioxidant treatment on pH of beef during storage

2.2 不同抗氧化剂处理对产品贮藏期间pH的影响

表2反映的是不同复合抗氧化剂处理对产品贮藏期间pH的影响。pH大小直接影响肉制品中微生物的生长状况，这是由于微生物细胞膜的电荷性质以及细胞中蛋白质易受氢离子浓度的影响。由表可知产品在贮藏期间pH的变化是波动的，贮藏0 d时，各处理组之间无显著性差异（P>0.05），在贮藏0～30 d，产品pH整体呈现下降趋势，这可能是由于在真空包装条件下，微生物主要以无氧酵解进行代谢活动，产生的CO2溶解在肉表面形成碳酸，造成了pH的降低[13]，pH的降低，抑制了腐败菌对蛋白质的分解，从而减少了胺类等亚硝胺前体物质的产生[14]。产品中的微生物通过代谢将产品中的糖类等物质分解成乳酸等酸性物质（或食品原料本身酶的消化作用），随着贮藏过程的进行，肉中的蛋白质被分解为氨和胺类化合物等碱性物质，pH有升高的趋势[15]。贮藏60 d时对照组处理1的pH最大为6.47，显著高于第二组（6.40）与第五组（6.37）（P<0.05）。总体而言，在贮藏期间不同复合抗氧化剂处理组的产品pH无明显的差异。

2.3 不同抗氧化剂处理对产品贮藏期间硫代巴比妥酸值（TBARS）的影响

表3反映的是不同抗氧化剂处理对产品贮藏期间TBARS值的影响。由表可知，TBARS值在五香酱牛肉贮藏期间呈现波动变化，但总体是上升的趋势，即随着贮藏时间的延长，其TBARS值显著升高。贮藏0 d时各处理组之间无显著性差异（P>0.05），随着贮藏时间的延长，各处理组的TBARS值呈逐渐升高的趋势。而五个处理组之间相比，复合抗氧剂处理组的TBARS值明显低于对照组，尤其是第五组的抑制氧化效果最显著（P<0.05）。可见乳酸链球菌素、丁香、迷迭香、肉桂协同复合作用时对产品的保鲜效果较佳。研究已证实乳酸链球菌素可对微生物细胞产生吸附形成“穿膜”孔道[16]，迷迭香能通过捕获过氧自由基来抑制过氧化链式反应的发生[17]，丁香中的丁香油和肉桂中的挥发油等抗氧化活性成分会对产品具有良好的杀菌和抗菌作用[18]。因此，第五组的复合抗氧化剂具有较好的抑制氧化效果（第五组60 d的TBARS值为0.30 mg/kg），其显著小于同一贮藏时间的其它处理组（P<0.05）。这与Armenteros等[19]的研究结果一致。Armenteros等[19]研究丁香、肉桂、大蒜油处理火腿，贮藏在−80 ℃条件下，TBARS在30～150 d的趋势总体也呈上升的趋势。贮藏过程中第15～30 d TBARS值出现波动的原因可能是由于次级产物丙二醛与氨基相互作用生成1-氨基-3-氨基丙烯，导致TBARS值下降，且贮藏过程中五香牛前腱的保鲜效果与王梓昂[20]的研究结果一致。以上研究结果表明乳酸链球菌素、丁香、迷迭香和肉桂等天然保鲜剂复合协同保鲜可显著降低产品在贮藏期间的TBARS值。

2.4 不同保鲜剂对贮藏期间产品菌落总数的影响

微生物在产品贮藏期间会发生复杂的变化，同时产生相应的化合物，这些生成物使食品发生变质的同时还会危害消费者的健康状况，如硫化物、生物胺、醇、酮、有机酸的产生。由表4可知，在贮藏期间，各个天然保鲜剂处理组对五香牛前腱的菌落总数影响是不同的，在同一贮藏时间，对照组的菌落总数高于其它处理组，贮藏0 d时，各处理组之间无显著性差异（P>0.05），随着贮藏时间的延长，菌落总数呈现增加的趋势，而且从表中数据可知，贮藏15 d时，第五组的菌落总数显著小于第二组、第三组、第四组的菌落总数（P<0.05），可见复合保鲜第五组的0.05%乳酸链球菌素+0.05% 丁香+0.03% 迷迭香+0.12%肉桂的保鲜效果好于其它处理组。

2.5 不同抗氧化剂处理对产品贮藏期间挥发性盐基氮值（TVB-N）的影响

表5反映的是不同抗氧化剂处理对产品贮藏期间TVB-N的影响。 挥发性盐基氮是细菌分泌的蛋白酶对蛋白质的分解作用，此过程中可产生胺类等碱性含氮物质[21]。由表5可知，随着贮藏时间的延长，产品中微生物的生长速度逐渐加快，TVB-N的数值也相应提高。0 d时，各处理组之间无显著性差异（P>0.05）。随着贮藏时间的延长，各处理组的TVB-N总体上均高于0 d。其中在同一贮藏时间下，加入抗氧化剂的处理组较对照组明显降低，其中第五组的TVB-N明显低于其他处理组。这可能是由于第五组中的乳酸链球菌素的抑菌效果和迷迭香、丁香、肉桂中抗氧化组分发生协同作用，从而起到较为明显的抑制效果。相关研究中 Sharma等[22]等同样发现用丁香、肉桂、圣罗勒、百里香处理过的鸡肉香肠在−18 ℃的贮藏过程中与对照组相比，发现丁香的加入使产品的氧化速率放慢。而且结合表4和表5的研究结果得出，随着贮藏时间的延长，菌落总数呈显著增长，研究证实随着微生物的增长，其分解蛋白质等含氮有机物的能力也随之增强，这可能导致产品的TVB-N数值加速増长，这与丁婷等的研究结果一致[23]。试验结果同时也说明了表2在贮藏后期pH上升的可能原因。五香牛肉贮藏较前期（0～15 d），挥发性盐基氮含量变化不显著（P>0.05），这可能归因于低温灭菌后产品残留微生物分解蛋白质的能力还很弱，而且牛前腱基质本身具有的缓冲能力，中和了一部分碱性物质所致，在贮藏期15 d后其含量开始上升，可能与微生物增殖造成蛋白质分解，致使碱性含氮物质开始发生积累现象有关[24]。30 d时，第五组的TVB-N仍优于其他处理组，且差异显著（P<0.05）；60 d时，第五组的TVB-N与其他组在45 d时的效果相似，该结果说明第五组多种天然抗氧化剂协同保鲜作用较好。

表3 不同抗氧化剂处理对牛肉贮藏期间硫代巴比妥酸反应物值（mg/kg）的影响Table 3 Effect of different antioxidant treatment on thiobarbituric acid-reactive substances (mg/kg) of beef during storage

表4 不同保鲜剂处理对五香牛前腱贮藏期间菌落总数（lg（CFU/g））的影响Table 4 Effect of different antistaling agent on total viable count(lg(CFU/g)) of spiced bovine fore shank during storage

表5 不同抗氧化剂处理对牛肉贮藏期间挥发性盐基氮值（mg/100 g）的影响Table 5 Effect of different antioxidant treatment on total volatile basicnitrogen(mg/100 g) of beef during storage

2.6 不同抗氧化剂处理对产品贮藏期间亚硝酸盐残留量的影响

表6反映的是不同抗氧化剂处理对产品贮藏期间亚硝酸盐残留量的影响。亚硝酸盐对微生物的增殖具有抑制作用，与食盐并用可增加抑菌效用，但是过多的摄入亚硝酸盐会引起血红蛋白转变为正铁血红蛋白，造成机体失去携氧功能，但亚硝酸盐具有的抑制肉毒梭状芽孢杆菌产生肉毒素的特殊作用使其在食品中较难替代[25]。由表可知亚硝酸盐残留量随着贮藏时间的延长呈现减少的趋势，贮藏0 d时各处理组的亚硝酸盐残留量差异不显著（P>0.05），但复合抗氧化剂处理组与对照组相比，亚硝酸盐残留量高于复合抗氧化剂处理组，这可能是由于迷迭香、肉桂、丁香等植物抗氧剂中存在的抗氧化成分二萜酚类化合物（phenolic diterpenes）以及其具有的提供氢原子中断自由基链式反应的作用均对亚硝酸盐的含量有降低的作用。随着贮藏时间的延长，亚硝酸盐残留量也逐渐降低，这是由于在贮藏过程中，肉制品中的微生物能将亚硝酸盐分解为NO，NO与肌红蛋白反应形成稳定的呈色络合物，同时亚硝酸根还会与巯基物质发生发生反应，从而降低了亚硝酸盐的残留量。贮藏60 d时，第一组（对照组）的亚硝酸盐残留量最高为1.42 mg/kg，显著低于贮藏0 d的亚硝酸残留量（P<0.05），第五组的亚硝酸盐残留量为1.29 mg/kg，也显著低于0 d（P<0.05）。

表6 不同抗氧化剂处理对牛肉贮藏期间亚硝酸盐残留量（mg/kg）的影响Table 6 Effect of different antioxidant treatment on residual content of nitrite (mg/kg) of beef during storage

表7 不同抗氧化剂处理对牛肉贮藏期间感官品质的影响Table 7 Effect of different antioxidant treatment on sensory quality of beef during storage

2.7 不同抗氧化剂处理对产品贮藏期间感官评定的影响

由表7可知，不同抗氧化剂处理对不同的贮藏期间内的产品的感官评价显著不同（P<0.05），随着贮藏过程的延长，颜色、风味、状态、滋气味、总体可接受性整体呈现下降的趋势，且每组样品的0 d和60 d之间都存在差异显著性（P<0.05）。对于相同贮藏期间不同处理组来说，0～15 d期间各处理组之间总体可接受性差异不显著（P>0.05）。颜色在45 d时第一组和第五组之间存在差异显著性（P<0.05），45 d时，第一组、第四组两组与第五组的组织状态之间差异显著（P<0.05），第二组、第五组两组与第一组的总体可接受性存在显著差异（P<0.05）；60 d时，第一组和第五组总体可接受性之间差异显著（P<0.05）。这可能是因为，蛋白质贮藏过程中，蛋白质和醛类相互作用导致蛋白质变性和聚集，使肉制品发生品质的变化[26]。肉中脂肪发生氧化时，肉中的多不饱和脂肪酸、色素、脂溶性维生素减少，产生酸败味，从而影响肉制品的品质。

3 结论

本研究结果表明在低温贮藏条件下使用使用不同的天然抗氧化剂对五香酱牛肉的货架期有一定的影响。与第一组相比，不同复合天然抗氧剂对五香牛肉的微生物、TVB-N、pH、TBARS值和感官指标均具有积极作用。其中第五组0.05 %乳酸链球菌素（Nisin）+0.05% 丁香+0.03% 迷迭香+0.12% 肉桂复合抗氧化剂的保鲜效果最好，感官评价指标最高。与对照组相比，60 d时，第五组的TBARS值为（0.30±0.01）mg/kg，在60 d时挥发性盐基氮值为（12.08±0.21）mg/100 g，菌落总数为（3.81±0.04）lg（CFU/g），差异显著（P<0.05）；感官评定分析结果也同样得出：60 d时第五组的总体可接受性显著高于对照组（P<0.05）。因此，本文的研究结果表明不同天然抗氧化剂复合可作为提高五香牛肉货架期的良好防腐保鲜剂。