辣椒上TRV 介导的番茄斑萎病毒N 基因沉默体系构建及鉴定*

李慧芳，桂 敏，张萍萍，张美玲，李永忠，刘雅婷

(1.云南农业大学 农学与生物技术学院，云南 昆明 650201；2.云南农业大学 植物保护学院，云南 昆明 650201；3.云南农业大学 烟草学院，云南 昆明 650201)

番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt orthotospovirus，TSWV)属于番茄斑萎病毒科(Tospoviridae)正番茄斑萎病毒属(Orthotospovirus)[1]，于1915 年在澳大利亚首次被发现[2]。其寄主范围广泛，可侵染80 多科1 000 多种植物[3-4]，在欧美、亚洲及大洋洲等多个地区广泛分布，造成严重的经济损失[3,5-6]，已被列为世界十大农业病害之一[7]。近年来，TSWV 在中国云南、贵州和广西等地流行发生，严重危害当地番茄、辣椒、烟草和花卉等农业生产的健康发展[4,8-9]。TSWV 是三分子基因组，包括L、M 和S 等 3 条RNA 链。S 链负链编码核衣壳蛋白(nucleocapsid protein，N)[4]，负责包裹病毒基因组RNA，参与病毒的多种生物学过程，其序列保守程度较高，作为本属病毒分类的重要依据[10]。N 蛋白能够与TSWV 的3个RNA 分子形成核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP)[11]，且N 蛋白的单体之间可以互作形成N蛋白多聚体[12]，这一现象对于病毒RNPs 的组装非常重要。N 蛋白在病毒RNA 合成的早期起关键作用，可能参与病毒基因组复制和转录[13]。有研究表明：N 蛋白与病毒在寄主体内的长距离运输有关[14-15]。它可在植物细胞内形成高速运动的颗粒，并能够通过与微丝马达蛋白互作运动[16]。最新研究发现：在本氏烟上沉默N基因可使本氏烟抵抗TSWV[17]，但N基因在辣椒上的抗病研究还未见报道。

在植物宿主感染期间，病毒须克服宿主防御，RNA 沉默是一种高度保守的病毒防御机制。病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing，VIGS)是一种快速沉默目的基因、鉴定基因功能的反向遗传学新技术[18-19]，主要应用于植物的抗病基因以及与代谢和发育相关基因的研究[20]。目前，开发应用于VIGS 的病毒载体主要有三大类[20]，包括由RNA 病毒改造、由DNA 病毒改造和由卫星病毒改造而来的载体。其中，烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)是目前使最广泛的RNA 病毒载体[21]。TRV 因其在寄主上侵染后对寄主本身的影响较小[22]，已应用于茄子、棉花、烟草和番茄[21-24]等多种植物的基因功能研究。八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase，PDS) 是类胡萝卜素生物合成的关键酶，当类胡萝卜素合成途径被阻断后，植物出现白化现象，常作为表型对照来监测沉默效果[25-26]。本研究将TSWV 病毒的N基因构建到TRV 载体上，转化农杆菌侵染辣椒后，通过qRT-PCR 分析发现该载体可高效沉默N基因。该沉默载体的构建一方面可为TSWV 病毒N基因在致病等方面的研究提供前期依据，另一方面也为后续开展辣椒抗病基因分子育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

TSWV (JC-1)毒源和易感TSWV 的辣椒(Capsicum annuumL.)湘研11 号种子均由本课题组保存；病毒载体pTRV1 和pTRV2 由云南农业大学植物保护学院陈小姣惠赠。

1.2 总RNA 提取、目的基因扩增及克隆

采用TRNzol-A+(天根生化科技有限公司，北京)试剂盒提取样品总RNA，利用Prime ScriptTMⅡ1st strand cDNA Synthesis Kit (宝生物技术有限公司，大连)进行反转录合成 cDNA。根据Gen-Bank 中公布的TSWV 的N基因序列(GenBank登录号：JN664252.1)和辣椒的CaPDS基因序列(GenBank 登录号：X68058)设计特异性引物(表1)。

表1 目的片段扩增引物Tab.1 Primers for amplification of target fragments

用Prime STAR®Max (宝生物工程有限公司，大连) 高保真DNA 聚合酶扩增目的片段，PCR 反应体系为：Prime STAR Max Premix (2×)25 μL、正向引物和反向引物各2.5 μL 以及cDNA 2.5 μL，补充灭菌蒸馏水至50 μL。PCR 反应条件：98 ℃ 20 s；98 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，35 个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。PCR 产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。将PCR 目的片段纯化并用Tailing-A Reaction Kit 试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)进行加A 反应，反应体系为：经纯化的平末端DNA 片段15 μL、Tailing-A Reacton Buffer 4 μL、TaqDNA polymerase (2.5 U/μL) 1 μL；混匀后，72 ℃孵育30 min。加A 后的产物与克隆载体pMD18-T 相连，热击法转化DH5α 大肠杆菌感受态细胞(宝生物工程有限公司，大连)，涂板过夜培养，经氨苄霉素(Ampicillin，100 mg/L)抗性和通用引物M13-47/48 扩增菌液PCR，筛选的阳性重组子送上海生工进行菌液测序。

1.3 沉默载体构建

将扩增得到的N基因和CaPDS基因PCR 产物用限制性核酸内切酶XbaI 和SacI [赛默飞世尔科技(中国)有限公司，上海]进行双酶切，将双酶切产物纯化，用T4 DNA 连接酶连接到同样用XbaI 和SacI 双酶切的pTRV2 载体中，转化大肠杆菌DH5α，利用卡那霉素(Kanamycin，50 mg/L)的抗性条件和菌液PCR 筛选阳性重组子并测序验证。

1.4 沉默体系的建立

将转化大肠杆菌DH5α 的阳性重组子pTRV2-N和pTRV2-CaPDS提取质粒。根据农杆菌GV3101 (吐露港生物科技有限公司，上海)说明书，将质粒转入农杆菌GV3101，并在卡那霉素(50 mg/L)和利福平霉素(Rifampicin，25 mg/L)抗性条件下筛选转化子。分别培养含有pTRV2-CaPDS、pTRV2-N和pTRV1 质粒的农杆菌GV-3101，各取菌液1 mL 加入20 mL 的YEB 培养基(含25 mg/L 利福平和50 mg/L 卡那霉素)中继续扩大培养，28 ℃，过夜。离心收集菌体，加入侵染液(含10 mmol/L MgCl2、10 mmol/L MES和200 μmol/L 乙酰丁香酮)悬浮菌体，调整菌液OD600至1.0 左右，暗处孵育4～6 h，为注射侵染做准备。

取等体积的 pTRV1 农杆菌重悬液与空病毒载体 pTRV2 农杆菌重悬液充分混合，作为阴性对照；取等体积的 pTRV1 农杆菌重悬液与重组病毒载体 pTRV2-CaPDS农杆菌重悬液充分混合，作为阳性对照；取等体积的pTRV1 农杆菌重悬液与重组病毒载体pTRV2-N农杆菌重悬液充分混合，作为试验组，用于注射侵染。以在光照培养箱内培养至2～4 叶期的辣椒幼苗为待侵染材料，每组10 株，用一次性无针头1 mL 注射器对幼苗叶背部进行注射侵染[27]。注射侵染前可先轻微制造创伤，再将菌液注射进辣椒幼嫩叶片背部；叶片经注射侵染后可观察到明显的圆形水渍状痕迹。侵染后的植株置于22 ℃、湿度50%和光周期L∶D=16 h∶8 h 的光照培养箱内培养。待注射了pTRV2-CaPDS的辣椒植株心叶出现白化现象后，开始对注射pTRV2 菌液(阴性对照)和pTRV2-N菌液(试验组) 的植株分别机械摩擦接种TSWV。同时以不做任何处理的健康植株为空白对照，只接种TSWV 且不注射任何载体菌液的植株为阳性对照。在光照培养箱内培养，观察辣椒的表型变化。采集显症样品进行沉默效率检测。

1.5 qRT-PCR

所采样品植物总RNA 按照TRNzol-A+提取试剂盒说明进行操作。用HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper) (诺唯赞生物科技有限公司，南京)合成cDNA。Actin(GenBank登录号：XM_016722297.1)设计内参基因，设置3 个平行试验，qRT-PCR 引物使用Primer Premier 6.0 软件设计(表2)。用ABI 7500 PCR 仪，参照SuperReal Premix Plus (SYBR Green)试剂盒(天根生化科技，北京) 说明书进行。反应体系为：cDNA 1 μL，正向引物和反向引物各0.5 μL，2×SYBR®Green Super mix 5 μL，ddH2O 3 μL；反应程序为：95 ℃ 3 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40 个循环。

表2 实时荧光定量引物Tab.2 Primers for qRT-PCR

1.6 数据处理

利用2-ΔΔCt法计算各个样品的基因相对表达量，试验数据用Excel 2010 进行统计，SPSS 26.0 对所有数据在P＜0.01 水平上进行Duncan’s多重比较差异显著性分析，应用Origin 2019b 软件作图。

2 结果与分析

2.1 辣椒总RNA 的提取和鉴定

由图1 可知：辣椒叶片的总RNA 电泳结果可观察到明亮完整的3 条带，说明提取的辣椒总RNA 完整，可用于后续试验。

图1 辣椒叶片总RNAFig.1 Total RNAs of pepper

2.2 辣椒 PDS 基因和TSWV N 基因片段克隆及序列分析

pMD18-T 空载体通用引物M13-47 和M13-48 可扩增130 bp 的条带；与目的片段CaPDS连接后，片段长度应该为520 bp；与目的片段N连接后，片段长度应该为355 bp。观察琼脂糖凝胶电泳图(图2)发现：在500～750 bp 和250～500 bp之间分别有1 条清晰条带。结合测序结果可知：目的基因CaPDS片段长度为390 bp，目的基因N片段长度为225 bp，片段大小与预期结果一致，且阴性对照没有扩增出条带。将验证正确的重组质粒命名为pMD18-T-CaPDS和pMD18-TN，可用于下一步试验。

图2 目的基因pMD18-T 载体片段扩增Fig.2 Target gene pMD18-T vector fragment amplification

2.3 成功获得TSWV N 基因和辣椒CaPDS 基因的病毒沉默载体

所获得的重组沉默载体结构如图3 所示。pTRV2 载体中的2 个花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus，CaMV) 35S 启动子(2×35S)和胭脂碱合酶终止子(nopaline synthase terminator，N)之间的多克隆位点处是已连接的带有XbaI 和SacI 双酶切位点的目的基因片段(CaPDS基因和N基因)。

图3 目的基因重组病毒载体的结构Fig.3 Structure of recombinant viral vector of target gene

由图4 可知：重组病毒载体扩增结果与目的基因片段的序列完全一致，说明成功构建病毒N基因的病毒沉默载体pTRV2-N和辣椒CaPDS基因的病毒沉默载体pTRV2-CaPDS，可以用于侵染辣椒植株。

图4 目的基因TRV 病毒载体片段扩增Fig.4 Target gene TRV viral vector fragment amplification

2.4 辣椒接种重组TRV 沉默载体后的表型分析

CaPDS基因作为阳性对照，作为沉默成功的表型指示，当沉默辣椒CaPDS基因后，植株的叶片就会受到光的漂白而呈现白色。侵染3 周，观察发现接种重组pTRV2-CaPDS病毒载体的植株叶片出现白化现象(图5)，随着接种时间的延长白化症状会越加明显。其中接种pTRV2 空载体的阴性对照组辣椒植株无症状，说明空载体对辣椒表型无影响。从白化表型上也可说明TRV病毒诱导的基因沉默载体在辣椒中构建成功。

图5 沉默辣椒CaPDS 的白化表型Fig.5 Albino phenotype of CaPDS silenced pepper plants

3 周左右，先接种含pTRV1 和空病毒载体侵染菌液后接种TSWV 的辣椒植株在其新叶及老叶上可观察到明显的褪绿、黄化斑、皱缩和坏死斑症状。而先接种含有pTRV1 和pTRV2-N沉默载体侵染菌液后接种TSWV 病毒的辣椒植株，其新叶无症状，老叶观察到叶片尖部畸形(图6)。结果表明注射pTRV2-N沉默载体的辣椒植株对TSWV表现出一定抗性。

图6 TSWV 侵染N 基因沉默后的辣椒表型Fig.6 Phenotype of pepper infected by TSWV after N gene silencing

2.5 接种辣椒的TSWV N 基因表达水平分析

由图7 可知：接种了含pTRV2 空病毒载体的对照组和试验组中N基因的表达量存在较大差异。辣椒N基因沉默体系在接种TSWV 后与对照组相比，被TSWV 侵染的叶片中N基因表达量极显著降低，仅为对照组的6.79%±2.56% (P＜0.01)。说明辣椒N基因沉默体系可以高效沉默接种到辣椒植株上的TSWV 病毒的N基因，同时也在分子水平上说明由TRV 病毒介导的N基因沉默体系在辣椒上有效。

图7 TSWV N 基因的相对表达量Fig.7 Relative expression of TSWV N gene

3 讨论

TSWV 在全球范围内广泛分布，一般发生在温带地区和亚热带地区，已成为侵染农作物和花卉最严重的病原之一。研究表明：TSWV 在云南以逐年上升的趋势快速扩张[28]，从海拔300 m 的热带气候到海拔3 000 m 的寒带气候均有分布[29]。目前的农业防治和物理防治方法不能长期有效控制TSWV 的蔓延，而施用过多的化学药剂也对生态环境造成严重威胁。辣椒抗病资源的筛选和抗病品种的选育一直是防控TSWV 的重要途径[30]。现已发现辣椒抗TSWV 的材料有PI159236、PI15-2225、CNPH275、7 204、PI15 和C00943 等[31-35]。王立浩等[36]利用种间杂交和分子标记辅助回交选育方法将PI152225 中的Tsw基因转到中椒系列骨干亲本一年生辣椒 (C.annuumL.) 大果甜椒自交系0516 中，选育出抗TSWV 的辣椒品种0516。但由于Tsw是单显性基因遗传，TSWV 突变株系不断产生，寻找广谱抗性基因和培育抗性持久的抗病资源是今后育种工作的重要方向[37-39]。VIGS技术作为一种能快速分析植物目标基因功能的方法，已经成功运用在辣椒部分功能基因的研究中[27]，但目前以辣椒为寄主沉默外源的病毒基因研究其抗性鲜有报道。TRV 是单链RNA 病毒，基因组由RNA1 和RNA2 两部分组成，经改造过的RNA1 (pTRV1)携带病毒复制和转运所必需的基因，RNA2 (pTRV2)编码必要的病毒外壳蛋白。在TRV-VIGS 体系中，目标基因序列通常被连接到pTRV2 多克隆位点上[40]。本研究成功构建了TSWVN基因的沉默载体pTRV2-N。利用农杆菌注射接种辣椒湘研11，3 周后观察发现辣椒新叶无症状，老叶叶片尖部出现畸形，这种现象可能是因为VIGS 引起的沉默在靠近生长点的部位效果最佳[21]，且通常不能完全抑制目的基因的表达[19]。与未接种N基因沉默载体的对照组相比，N基因的表达量仅为对照组的6.79%，该沉默载体可高效沉默N基因，使得易感TSWV病毒的辣椒品种湘研11 对TSWV 有抗性。为后续从分子层面通过基因沉默技术对辣椒相关抗病基因功能的验证提供了高效的技术平台。目前VIGS 系统仍存在一些问题，如在植株各个部位的目标基因沉默不彻底、沉默效率不一致[41]等，可通过对体系的优化和增加试验重复等来克服[17]。随着高通量测序技术的快速发展，大量未知基因被发现。VIGS 技术简单快捷，有望成为鉴定大量基因功能的主要工具[42]。VIGS 技术中的主要成分是双链RNA，它在生物中普遍存在，在自然环境中也易降解，无毒，残留时间短，是一种绿色环保的抗病虫技术，对作物病虫害绿色防控也有巨大的应用前景[43-44]。

4 结论

本研究利用VIGS-TRV 病毒载体构建了TSWV 病毒基因沉默体系。利用该体系可高效沉默TSWVN基因；结合表型及基因表达水平分析，沉默TSWVN基因后辣椒对入侵的TSWV产生一定的抗性。同时，该体系可为后续病毒致病机制的研究提供依据。