Vps4b基因敲除鼠上皮根鞘中细胞角蛋白14和增殖细胞核抗原的表达

田晴 王莹莹 李强 陈栋

1.郑州大学第一附属医院河南省口腔医院口腔科，郑州450052；2.徐州市中心医院口腔科，徐州221009

遗传性牙本质发育异常是牙本质矿化及结构异常的一类常染色体显性遗传病。不同于以往的Shield 关于牙本质发育异常的分类[1]，目前学者[2]更倾向将其分为牙本质发育不全（dentinogenesis imperfecta，DGI）和根部牙本质发育不良（radic‐ulardentin dysplasia）即牙本质发育不良Ⅰ型（den‐tin dysplasia-Ⅰ，DD-Ⅰ）两类。DD-Ⅰ是一种牙冠形态大致正常而牙根畸形导致青少年时期牙齿自发脱落的常染色体显性遗传病，该病具有遗传异质性[3]。目前已报道的致病基因有SMOC2、SSUH2 和VPS4B[4-6]。本课题小组在豫北地区发现一个致病基因为VPS4B的DD-Ⅰ家系[6]。

在牙冠即将发育完成时，牙根开始形成。此时在颈环处由内外釉上皮细胞增生形成不含星网状层和中间层细胞的双层上皮结构，即上皮根鞘（Hertwig’s epithelial root sheath，HERS）[7]。HERS是牙根发育的启动中心，在牙根发育中发挥重要作用[8-9]。其可诱导内侧的牙乳头细胞分化为牙本质细胞，生成根部牙本质。根部牙本质形成时，HERS 发生断裂，外侧的牙囊细胞与牙本质接触，分化成牙骨质细胞，进而形成根部牙骨质。细胞角蛋白14（cytokeratin 14，CK14）是一种具有很强特异性的牙源性上皮标记蛋白[9]，常用来标记釉质上皮。增殖细胞核抗原（proliferating cell nucle‐ar antigen，PCNA）在DNA 复制中必不可少，可表达于细胞周期的各个阶段，通过监测PCNA 细胞核阳性表达的高低可观察细胞增殖活性强弱[10]。VPS4B 是一种多功能蛋白，可降解溶酶体、转运胞内蛋白和病毒出芽。HERS的形态、增殖及凋亡对牙根的发育至关重要。本研究拟通过免疫组织化学染色技术来检测正常小鼠和Vps4b基因敲除小鼠磨牙牙胚中的HERS 形态以及细胞内CK14 和PCNA 的表达情况，进一步探讨Vps4b 基因突变对牙根发育异常的可能影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物和主要试剂、设备

野生型C57BL/6J 体系小鼠（济南朋悦实验动物繁育有限公司），Vps4b 基因敲除鼠（南京大学-南京生物医药研究院）。KAPA 快速DNA 提取试剂盒（北京普凯瑞生物科技有限公司），Taq 聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增试剂盒、寡核苷酸引物（北京鼎国昌盛生物技术有限公司），PCR 扩增仪（Eppendorf 公司，德国），CK14 抗体和PCNA 抗体（北京博奥森生物技术有限公司），光学显微镜（Olympus公司，日本）。

1.2 方法

1.2.1 标本的制备 在同一时刻将基因敲除雄鼠与正常雌鼠以1∶2 的比例交配，新生小鼠出生当天中午计作出生后（postnatal，P）0.5 d，用无菌剪刀剪下2~3 mm 出生后新生小鼠鼠尾，置于1.5 mL离心管，待进行基因型鉴定，剪取时注意避免交叉污染。断颈法处死出生后5 d（P5 d）、9 d（P9 d）、11 d（P11 d）、15 d（P15 d）以及19 d（P19 d）的新生鼠，使用眼科剪和眼科镊分离双侧下颌骨组织，4%多聚甲醛溶液固定24 h，10%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）溶液脱钙3~6 d，梯度乙醇脱水，浸蜡，包埋，制备5µm的连续切片。

1.2.2 基因型的鉴定 剪碎新生小鼠尾巴，置于1.5 mL 离心管内，提取小鼠基因组DNA（genom‐ic DNA，gDNA）。采用25 μL PCR 反应体系，根据使用说明，待测gDNA 0.5 μL，Taq DNA 聚合酶0.5 μL，引物 1 μL，dNTP 0.5 μL，10×Taq 缓冲液2.5 μL，ddH2O 20 μL 混匀后离心数秒，放入 PCR仪扩增。设计2 种Vps4b gDNA 基因型鉴定引物，见表1。PCR 反应程序：Vps4b-1 进行94 ℃预变性5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循环35次，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存；Vps4b-2进行95 ℃预变性 5 min，95 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃30 s， 循 环 20 次 ， 然 后 95 ℃ 30 s， 55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循环 20 次，72 ℃延伸 10 min，16 ℃保存。取扩增产物5 μL，加入琼脂糖凝胶孔内，观察电泳结果。

1.2.3 免疫组织化学染色 取P5 d、P9 d、P11 d、P15 d、P19 d新生鼠的双侧下颌骨组织，通过苏木精-伊红（hemotoxylin and eosin，HE）染色确定不同时期小鼠下颌第一磨牙牙胚的切片，再使用免疫组织化学法染色。切片脱蜡，乙醇溶液梯度复水，微波炉中蒸煮pH 6.0 的柠檬酸抗原修复液至沸腾后放入切片90 s，PBS 冲洗5 min×3 次；在切片组织上避光滴加3%H2O2，静置30 min，盖上盖子，PBS 冲洗5 min×3 次；滴加适量10%兔血清，室温封闭1 h；分别滴加1∶100 稀释的CK，1∶200 稀释的PCNA，封盒，4 ℃冰箱内过夜保存；PBS冲洗5 min×2次，滴加二抗，37 ℃湿盒内静置30 min；PBS 冲洗 5 min×2 次，滴加辣根过氧化物酶，37 ℃下放置30 min；滴加DAB 显色，苏木素复染，乙醇溶液脱水，二甲苯溶液（Ⅰ）、二甲苯溶液（Ⅱ）中透明，滴加中性树胶封固，观察切片并拍照。

1.2.4 免疫组织化学结果判定 在100 倍下观察染色情况，颜色明显高于背景的记为强阳性，高于背景的记为阳性，略高于背景的记为弱阳性，CK14 阳性物质位于细胞质内，PCNA 阳性物质位于细胞核内。CK14 胞质棕红色为阳性表达，蓝色为阴性表达；PCNA胞核棕褐色或棕黄色为阳性表达，蓝色为阴性表达。

2 结果

2.1 小鼠基因型鉴定结果

PCR 结果显示，F1/R1 作为引物，扩增出2 种条带，一种1 383 bp 条带，一种384 bp 条带（图1左）；F2/R2 作为引物，扩增出一种425 bp 条带（图1右）。这表明，新生小鼠中存在杂合型和野生型，不存在纯合突变型。

图 1 小鼠Vps4b gDNA扩增Fig 1 Amplification of Vps4b gDNA

2.2 不同发育时期HERS形态

CK14 抗体免疫组织化学可以观察到：正常小鼠P5 d 开始形成HERS，并向未来根尖方向生长；P9 d 开始出现根分叉结构，此时HERS 结构连续，外层为矩形细胞，内层为立方状细胞；到P11 d，一小部分HERS 结构开始发生断裂，HERS 细胞在牙根面呈簇状聚集；在P15 d，HERS 结构断裂，仅末端部分完整，此时牙根的1/3 已形成；P19 d牙根基本达到生理性发育的长度，HERS末端结构仍完整，断裂HERS 细胞紧贴牙根面（图2 上）。Vps4b 基因敲除小鼠同样于P5 d 形成HERS 结构；然而在P9 d，HERS 就开始断裂；在P11 d 到P15 d根尖HERS 结构完整，颈部呈不规则细胞簇；在P19 d 牙根表面仅存少量HERS 碎片，且根尖的发育不成熟（图2下）。

2.3 PCNA的表达分布

PCNA 免疫组织化学结果见图3。P5 d，PC‐NA 在正常小鼠颈部冠边缘附近的成釉细胞和HERS细胞中强阳性表达，牙囊细胞和牙乳头细胞中阳性表达；在Vps4b 基因敲除小鼠成釉细胞、HERS细胞、牙囊细胞及牙乳头细胞阳性表达，但强度降低。P9 d，PCNA 在正常小鼠牙乳头细胞中呈强阳性表达，成釉细胞、HERS细胞和牙囊细胞中阳性表达；在Vps4b基因敲除小鼠牙乳头细胞呈阳性表达，成釉细胞、HERS 细胞弱阳性表达。P11 d，PCNA 在正常小鼠牙乳头细胞呈阳性表达，成釉细胞、HERS 细胞和牙囊细胞中弱阳性表达；在Vps4b基因敲除小鼠牙根表面HERS 细胞中弱阳性表达，在牙乳头细胞中呈弱阳性表达。P15 d，PCNA在正常小鼠牙乳头细胞阳性表达，牙囊细胞弱阳性表达，牙根表面HERS 细胞中弱阳性表达；在Vps4b基因敲除小鼠牙囊细胞及牙乳头细胞阳性表达，HERS细胞中弱阳性表达。P19 d，PCNA仅在正常小鼠牙根末端HERS细胞中阳性表达、牙乳头细胞和牙囊细胞中弱阳性表达；在Vps4b基因敲除小鼠HERS细胞弱阳性表达，牙囊细胞及牙乳头细胞中无表达。

图 2 CK14免疫组织化学结果 ×100Fig 2 Immunohistochemical results of cytokeratin 14 ×100

图 3 PCNA免疫组织化学结果 ×100Fig 3 Immunohistochemical results of PCNA ×100

3 讨论

条件性基因敲除技术是研究基因的一种重要方法。本研究中的Vps4b 基因敲除小鼠是通过CRISPR-Cas9技术获得的[11]，均为杂合子，理论上子代小鼠有Vps4b+/+、Vps4b+/-、Vps4b-/-3 种类型。本研究中PCR 扩增显示子代小鼠中不存在Vps4b-/-纯合子，说明Vps4b基因在胚胎发育过程中起重要作用，且已有研究[12]表明Vps4b基因敲除小鼠纯合突变在胚胎早期发育阶段致死。VPS4B 基因通过Wnt-β-catenin 信号通路调节人牙髓干细胞（human dental pulp stem cells，hDPSCs）的增殖、迁移和向成牙本质细胞分化，在hDPSCs向成牙本质细胞分化过程中存在高度表达的VPS4B 蛋白。这表明Vps4b基因在牙齿发育中发挥重要作用。

正常牙根的发育与HERS密切相关，首先需要形成完整的HERS，继而HERS 在特定的时期断裂，同时HERS细胞发生凋亡。本实验中正常小鼠P11 d HERS 开始发生断裂，而Vps4b 基因敲除小鼠HERS 在P9 d 就开始断裂，最终牙根发育不完整，提示Vps4b 基因对牙根的发育有一定的影响。本研究利用PCNA 监测HERS细胞及其周围细胞的增殖活性，发现 P5 d 到 P19 d，PCNA 在 HERS 末端始终阳性表达，表明HERS细胞增殖在牙根生长发育中的潜在重要作用。与正常小鼠相比，Vps4b基因敲除小鼠P9 d 时HERS 结构就开始断裂，PC‐NA 在HERS 细胞、牙乳头细胞中的表达强度显著降低，P19 d 时PCNA 仅在HERS 细胞中弱阳性表达，因此本研究推测Vps4b 基因可能通过降低HERS 细胞及牙乳头细胞的增殖活性，影响HERS断裂的时间以及成牙本质细胞的形成，进而导致牙本质形成异常。

本研究通过免疫组织化学方法，观察到不同时期HERS 的形态变化以及PCNA 在Vps4b 基因敲除小鼠HERS中的表达改变，进一步推测Vps4b 基因突变导致HERS细胞增殖发生改变，最终引起牙根发育异常。VPS4B 基因可通过MAPK 通路调控细胞的数量变化[13]，本研究猜测Vps4b基因可能也通过MAPK通路调控HERS细胞的增殖凋亡。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。