基于三维荧光光谱的槐米中黄酮类物质的醇提分析

姚涵寻　粟晖　温健　姚志湘

摘 要：利用荧光总体积积分算法，结合三维荧光光谱技术，对槐米甲醇提取液中的黄酮类物质进行分析.以芦丁为对照，以甲醇为提取溶剂，设置不同时间、溶剂倍量和温度的条件，分析各条件下槐米甲醇提取液中黄酮类物质的提取情况;并在中草药浸提数学模型的基础上对不同条件下槐米的浸提过程进行动力学验证.结果显示，槐米甲醇提取液中黄酮类物质提取的较优条件为：热力学温度333 K，时间[≥]80 min，溶剂倍量[≤]100;在浸提动力学研究中，lnC分别与lnt、ln（M-R）、（1/T）×103成线性关系，符合中草药浸提的数学模型.

关键词：槐米;黄酮类物质;醇提;三维荧光;动力学

中图分类号：TQ91;R927.2  DOI：10.16375/j.cnki.cn45-1395/t.2021.02.015

0引言

槐米为豆科植物槐的干燥花蕾，具有清肝明目，凉血止血等功效，为常用中药[1].槐米中含有大量的黄酮类、多糖类、三萜皂苷类及醇类等成分，其中黄酮类含量高达20%以上，具有清除自由基、抗肿瘤、抗病毒等功效，也是槐米发挥药效的主要功能性成分[2-4].黄酮类物质不易溶于水，而易溶于醇，因此，用甲醇提取槐米中的黄酮类物质比用水提取效果更充分.

三维荧光光谱具有确定的维度优势，相比其他检测方法，三维荧光光谱法检测更灵敏，选择性更高，且取样容易，样品用量少，更方便快捷[5-7].研究中草药浸出过程的动力学关系，能够为有关中药提取的实验提供设计依据.张卫波等[8]通过对绞股蓝中的多糖进行提取，建立了多糖的提取动力学方程;魏小红等[9]用体积分数为90%的乙醇提取芹菜叶中的黄酮，并求得有关动力学参数;邓辉等[10]建立了丹参中的丹酚酸B的提取动力学方程，使浸提过程的条件选择更具有科学性.本文所得到的光谱是黄酮类物质的混合光谱，选择荧光总体积积分算法进行计算能够从整体上将黄酮类物质的含量表示出来，避免了其他算法的复杂性.

本文设计不同温度、时间及溶剂倍量3个条件对槐米进行提取，分析了槐米甲醇提取液的三维荧光特性，采用荧光总体积积分算法[11]对不同条件下提取的黄酮类物质进行定量分析，研究浸提过程中黄酮类物质浓度的变化规律，并以中草药浸提的数学模型为基础，对槐米的浸提过程进行动力学研究.

1实验方法

1.1   仪器和试剂

主要仪器有：同步吸收-三维荧光光谱仪（Aqualog-UV-800-C型，HORIBA集团）、电子分析天平（AL104型，上海梅特勒-托利多公司）、智能磁力搅拌器（ZNCL-G190*90型，巩义市予华仪器有限责任公司）.

槐米购于广西玉林中药材市场，产地为广西;芸香叶苷（98%，上海凛恩科技发展有限公司）.

1.2   槐米中黄酮类物质的浸提

在 100 mL甲醇中加入一定量的槐米，水浴回流，磁力搅拌转速450 r/min，在不同条件下进行浸提实验，其中浸提热力学温度为313 K、318 K、323 K、328 K、333 K，时间为10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，溶剂倍量（溶剂甲醇所需体积与槐米质量之比）為100、125、150、175、200.分别取出少量不同条件下的浸提液，稀释后进行三维荧光检测.

三维荧光检测条件：激发波长300～600 nm，积分时间0.5 s，步进3 nm.检测到原始数据后，得到系列样本三维光谱数据.

1.3   荧光总体积积分法定量分析浸提液

荧光总体积积分法是利用Monte-Carlo积分原理对特征物质峰进行体积积分，进而通过积分值来表示物质荧光强度的方法[12].荧光总体积积分算法相比于其他算法操作更简单，只需对原始数据进行选择处理便可进行计算，保留了数据的原始特点，能更好地体现数据的真实性.荧光总体积积分公式[13]如下：

[?=ExEmI（λExλEm）dλExdλEm]   （1）

式中：[?]为荧光区域的积分体积，au·nm2;[λEx]为激发波长，nm;[λEm]为发射波长，nm;[I（λExλEm）]为激发-发射波长对应的荧光强度，au.

精密称取芦丁对照品粉末0.030 0 g于烧杯中，甲醇溶解，配制得到质量浓度范围在20～1 200 μg/mL的对照品溶液.用荧光总体积积分方法计算芦丁对照品中特征峰的体积积分值，以对照品的浓度为横坐标，荧光体积积分值为纵坐标建立标准曲线.

对各浸提液及对照品的三维荧光光谱进行分析，选出样本及对照品中对应黄酮类物质的荧光响应峰，应用式（1），求取各样本和对照品的总体积积分值.

1.4   槐米中黄酮类物质的浸出动力学

储茂泉等[14-15]在假设中草药浸提的速率完全受扩散控制的前提下，根据Fick第一扩散定律推导出了中草药浸提过程中浸出物浓度与时间、溶剂倍量和温度的数学关系式，分别为：

[lnC=λ+Vlnt]  （2）

[lnC=a-Yln（M-R）]   （3）

[lnC=X-YT]（4）

其中：[C]为浸出物的质量浓度;[t]为浸提时间;[M]为溶剂倍量;[R]为药材充分吸湿所需的溶剂体积与干药材质量之比，可由实验得出;[T]为提取热力学温度;[λ]、[V]、[a]、[Y]、[X]均为常数.

分别取一定量的槐米，加入不同体积的甲醇，求取充分吸湿所需甲醇的体积[R].根据各单因素条件下浸提液中黄酮类物质的浓度，分别分析lnC与lnt、ln（M-R）、1/T的关系.

2結果和讨论

2.1   浸提液三维荧光谱图分析

对照品芦丁和浸提液样本的三维荧光光谱图如图1所示，芦丁对照品在[λEx]=430 nm、[λEm]=700 nm，[λEx]=425 nm、[λEm]=725 nm以及[λEx]=430 nm、[λEm]=530 nm处出现了3个主要的荧光峰.样本的荧光谱图与对照品相比，只有[λEx]=430 nm、[λEm]=700 nm和 [λEx]=425 nm、[λEm]=725 nm的两个峰，考虑是由于样本提取物中物质含量复杂，导致谱图出峰情况略有差异;或者由于[λEx]=430 nm、[λEm]=700 nm位置的峰强度太高以至于[λEx]=430 nm、[λEm]=530 nm位置的峰没有显现出来.根据对照品及样本的出峰情况，本文对[λEx]=430 nm、[λEm]=700 nm，[λEx]=425 nm、[λEm]=725 nm和[λEx]=430 nm、[λEm]=530 nm 3个位置的峰进行体积积分，得到的积分总和作为评价槐米浸出物多少的标准.

2.2   荧光总体积积分法定量分析浸提液

2.2.1   标准曲线的建立

采用荧光总体积积分方法计算芦丁对照品在20～1 200 μg/mL质量浓度范围内的体积积分值，得到标准曲线方程为y =22 133x+3×106，相关系数 r =0.998 7，具有良好的线性关系.

2.2.2   浸提条件下槐米中黄酮类物质浸出情况分析

根据标准曲线算得各样本质量浓度，进而分析槐米中黄酮类物质浸出量与温度、时间、溶剂倍量的关系，如图2所示.

由热力学温度与质量浓度的关系图（图2（a））可以看出，相同溶剂倍量条件下，随着温度的升高各时间点下的质量浓度也成上升趋势，其中在318～323 K和328～333 K时曲线斜率最大，浓度上升速度最快，在323～328 K时浓度基本无变化，因此，在这个温度范围时槐米品质成分的浸出经历了一个平台期.由于甲醇的沸点为337.85 K，所以在不超过沸点温度的前提下，提取温度越高，提取效率越高，文中选取333 K为甲醇提取的最适热力学温度.

由时间与质量浓度的关系图（图2（b））可以看出，在相同溶剂倍量的前提下，60 min之内，各温度下的质量浓度均随提取时间的增加而增加，说明在本次实验条件下，1 h的提取时间内，槐米中的黄酮类物质不会被提取完全.图3是在333 K浸提条件下黄酮类物质的质量浓度与时间的关系，由图3可以看出，在80 min左右黄酮类物质质量浓度达到最大值，并保持稳定，由此可知，在用甲醇为溶剂从槐米中提取黄酮类物质时，提取时间应尽量   [≥]80 min，否则提取效率过低，导致提取不完全.

由溶剂倍量和质量浓度的关系图（图2（c））可以看出，相同温度不同时间点下测得的样品质量浓度均随溶剂倍量的增加而减小，在溶剂倍量为100～125 时，有效成分浓度下降得最快，因此，在保证提取效率的前提下，槐米提取时的溶剂倍量应[≤]100.

2.3   槐米品质成分浸出动力学验证

本实验首先对槐米充分吸湿所需水的体积进行了实验获取，得到如表1所示的结果.对R值求平均为0.54 mL/g.

依据前文所得实验数据，研究lnC、lnt、ln（M-R）与1/T之间的关系，得到如图4所示的提取动力学关系图.

通过槐米浸提的动力学关系图可以看出，lnC与lnt、lnC与ln（M-R）、lnC与（1/T）×103均成线性关系，说明槐米中黄酮类物质的甲醇提取过程符合储茂泉等[14]提出的中草药浸提动力学方程，为实际槐米浸提条件的设置提供了参考.

3结论

用三维荧光光谱技术，结合荧光总体积积分算法，对槐米中黄酮类物质进行了甲醇浸提过程的研究和浸提动力学方程的验证.得到了槐米浸提的较优条件：提取热力学温度为333 K，时间[≥]80 min，溶剂倍量[≤]100.在浸提动力学研究中，得到了lnC与lnt、ln（M-R）、（1/T）×103的关系，均符合中草药浸提的数学模型所表示的线性关系.

通过对槐米醇提液中黄酮类物质浸出规律的研究，找到了浸提过程的较优条件，且证明了槐米中黄酮类物质的浸提符合一般中草药浸提的动力学模型，为以槐米为原料药的药品的生产加工提供了更科学的依据，能够节约生产成本，具有重要的现实意义.

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Alcohol extraction analysis of flavonoids in Sophora japonica based on three-dimensional fluorescence spectroscopy

YAO Hanxun， SU Hui， WEN Jian， YAO Zhixiang*

（School of Biological and Chemical Engineering， Guangxi University of Science and Technology，

Liuzhou 545006， China）

Abstract： Using fluorescence total volume integration algorithm， combined with three-dimensionalfluorescence spectroscopy technology， the flavonoids in the methanol extract of Sophora japonica were analyzed. The variation of substance content with extraction conditions during the extraction process was studied， and the extraction kinetic model was verified. Taking rutin as the contro， methanol as the extraction solvent， setting conditions of different time， solvent volume and temperature， and analyze the extraction of flavonoids in the methanol extract of Sophora japonica under various conditions; and based on the mathematical model of Chinese herbal medicine extraction Kinetic verification of the extraction process of Sophora japonica under different conditions. The results showed that the optimal conditions for extracting flavonoids from the methanol extract of Sophora japonica were the extraction temperature of 333 K，the time of no less than 80 minutes and the solvent volume no more than 100 mL/g; in the study of extraction kinetics lnC was compared with lnt and ln（M-R），（1/T）×103 are linear， which accords with the mathematical model of Chinese herbal medicine extraction.

Key words： Sophora japonica; flavonoids; alcohol extraction; three-dimensional fluorescence; kinetics

（責任编辑：罗小芬、黎   娅）

收稿日期：2020-10-20

基金项目：广西重点研发计划项目（桂科AB16380348）资助.

作者简介：姚涵寻，硕士研究生.

通信作者：姚志湘，博士，教授，研究方向：化学工程和过程分析技术，E-mail：zxyao@gxust.edu.cn.