白族药千斤坠粗提物急性毒性初步研究

郭羽 梁攀 李昌虎

【摘 要】 目的：考察白族药用植物千斤坠的安全性 以及寄生在红色和白色杜鹃灌丛下不同来源的千斤坠是否存在毒性差异。方法：小鼠单次灌胃给药 连续观察小鼠体重及毒性反应;对死亡小鼠主要脏器做组织切片检查;HPLC分析两种粗提物是否存在差异。结果：测得白花杜鹃下的千斤坠粗提物LD50为15.1 g/kg 并对心、肝、肺、肾等脏器有不同程度损伤;红花杜鹃下千斤坠粗提物未测得LD50;HPLC分析结果显示两种样品主成分差异不明显。结论：寄生在红、白花色杜鹃灌丛下的千斤坠存在安全性差异 白花杜鹃下寄生的千斤坠急性毒性显著 存在致死性;红花杜鹃下寄生的千斤坠则未发现致死性。研究结果与白族药用记载基本吻合。

【关键词】 千斤坠;粗提物;急性毒性;杜鹃;不同花色

Abstract：Objectives To explore the safety of the Bai Medicine， Qian-Jin-Zhui （Boschniakia Himalaica）， and to study the differences of the safety between the Qian-Jin-Zhuigrowing under azaleas trees with the red flower and white flower. Methods After single intragastric administration in mice，the weight and toxicity of mice were observed.The main organs of the testing mice were dissected and analyzed. The chemical differences between the two crude extracts of the Qian-Jin-Zhuiwere checked by means of high performance liquid chromatograph （HPLC）. Results The LD50 of crude extract of Qian-Jin-Zhui harvested under the azaleas with white flower was 15.1 g/kg， and it also caused the damages to heart， liver， lung， and kidney in different degrees. The LD50 of crude extract of the Qian-Jin-Zhui found under the azaleas with red flower could not be measured. HPLC analysis of the extracts indicated that there were no significant differences between the major constituents of thetwo samples. Conclusion There were safety differences between the Qian-Jin-Zhui growing under the azaleas with different flower colors. The Qian-Jin-Zhui growing under the azaleas with white flower was toxic and could cause death， while the lethality of the Qian-Jin-Zhui growing under the azaleas with red flower was not observed. This conclusionwas basically consistent with the records about Qian-Jin-Zhui from Bai medicines.

Keywords：Boschniakia Himalaica;Crude Extract;Acute Toxicity; Rhododendron Plants; Flowers With Different Colors

千斤墜（Boschniakia himalaica）为列当科草苁蓉属植物 又名丁座草 俗称枇杷芋、寄母怀胎 生于海拔2200～4600 m的高山林下或灌丛 寄生于杜鹃根上或松树根上;产云南大部分地区 大理有分布[1]。在白族医药中称为“荒优脂”（洱源）“德厚优”“继荒优”（云龙）“洋荒其”“瘦专脂”（剑川）“千荒优”（云龙关坪）[1] 具有理气、止痛、止咳、祛痰、消胀、健胃等功效 用于胃痛、腹痛、跌打损伤、风湿关节痛等病症[1];文献检索结果显示 该植物是否具有毒性方面记录较为混乱 多数文献未进行任何说明 少部分文献史料则显示该植物有小毒 其中尤以《白族惯用植物药》相关记录最为详尽[1]：“本品有毒。①据经验认为 服后能促使四肢汗出而邪去。②据民间使用经验 该种在白花杜鹃下寄生的有毒 有麻感 只能作酒浸外用。红花杜鹃下寄生的可内服。并视切片为白色者 副反应为吐泻。以切片黄色者佳 无副反应”。但实际情况如何未见有研究报道 因此是否如记载所述不得而知。课题组在前期开展的试验中发现 该植物可能具有一定的毒性与药用安全隐患 在多数植物样品常用的安全剂量范围内 千斤坠提取物试验组出现了小鼠大面积急性中毒甚至是死亡的现象。考虑到千斤坠在民族医药的常用性以及白族医药对该植物毒性方面的记述 该现象需要引起重视。为此 本研究针对千斤坠急性毒性以及寄生不同花色杜鹃下的千斤坠的毒性效果开展初步的研究工作 以期为该植物的安全应用提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 植物样品试验 用植物样品于2017年6月5日采自云南大理苍山大花甸至小花甸间 经大理大学生药学教研室张德全副教授鉴定为列当科草苁蓉属植物千斤坠（Boschniakia himalaica Hook. f. et Thomson）。采集时根据所寄生杜鹃花的颜色进行分类收集 最终整理成三组 分别是红花杜鹃下千斤坠组、白花杜鹃下千斤坠组、其它生境千斤坠组;本研究供试样品来自前两组千斤坠。

1.2 仪器与试剂 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂） COOL SAFE95-15冷冻干燥机（丹麦LABOGENE公司） Agilent 1260高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司） 甲醇[色谱纯 西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司] 超纯水（娃哈哈饮用纯净水） 0.5% CMC-Na（羧甲基纤维素钠 国药集团化学试剂有限公司）。

1.3 实验动物 SPF级昆明种小鼠 体质量（20±2） g 雌雄各半 购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司 生产许可证号SCXK（湘）2016-0002。小鼠分性别饲养于动物房内 以每天3 g/只喂标准颗粒饲料。

1.4 样品制备 红花杜鹃下与白花杜鹃下采集的两个千斤坠样品晾干后各取100 g粉碎 用70～80 ℃蒸馏水 超声30 min 过滤 重复3次。滤渣再用蒸馏水加热煮沸5 min进行粗提取 冷却至室温后 进行旋转蒸发浓缩 最后冷冻干燥 分别得到提取物（红花杜鹃下千斤坠）37.29 g、（白花杜鹃下千斤坠）37.31 g 提取率均为37.3% 密封备用。

1.5 急性毒性试验

1.5.1 预试验 取昆明种小鼠 随机分为若干组 每组4只 雌雄各半 试验前12 h禁食不禁水 各受試物均为1次灌胃给药 空白对照组给予等量溶媒（0.5% CMC-Na） 试验组给予不同剂量的供试样品 灌胃体积为0.2 mL/10g。试验剂量从1 g/kg开始测试 如果未出现小鼠死亡则增加剂量 直到出现死亡或达到最大给药量。给药后观察并记录动物的毒性反应 包括外观体征 行为活动 精神状态 食欲 大小便及颜色 被毛 肤色 呼吸及鼻、眼、口腔、生殖器等有无异常分泌物等[2]。

1.5.2 正式试验 根据预试验结果 红花杜鹃下千斤坠粗提物达最大给药量时未出现小鼠死亡 仅对白花杜鹃下千斤坠粗提物进行正式试验。取昆明种小鼠 随机分为5组 每组10只 雌雄各半 试验前12 h禁食不禁水 各受试物均为1次灌胃给药 空白对照组给予等量溶媒（0.5% CMC-Na） 试验组给予不同剂量的供试样品 根据预试验结果拟出以下4个给药剂量组：6.25、8.75、12.25、17.15 g/kg 剂间比为1.4 灌胃体积为0.3 mL/10 g[3]。

于给药前和给药后每天进行1次体重测定。于给药后0.5、1、2、4、6 h各观察1次毒性反应 以后每天观察1次 连续观察14 d 记录动物中毒表现和特点（包括外观体征 行为活动 精神状态 食欲 大小便及颜色 被毛 肤色 呼吸及鼻、眼、口腔、生殖器等有无异常分泌物） 毒性反应出现、消失时间、动物死亡时间。死亡小鼠及时摘取脏器并保存于10%中性甲醛。给药14 d后 摘取未死小鼠主要脏器并保存[4]。所有脏器经脱水、包埋、切片、HE染色进行病理组织观察。

1.6 HPLC分析 分别称取红、白两色花杜鹃灌丛下寄生的千斤坠粗提物 用色谱纯甲醇溶解为5 mg/mL 0.22 μm滤膜过滤 装于进样瓶中并做好标记备用。

HPLC分析条件为：流动相CH3OH-H2O;柱温30 ℃;流速0.8 mL/min;进样体积10 μL;检测波长225 nm;采用自动进样 Agilent Zorbax SB-C18（5 μm， 4.6×150 mm）色谱柱。流动相为水（A）与甲醇（B）梯度洗脱 0～5 min 5%B;5～30 min 5%～30%B;30～90 min 30%-60%B。

1.7 数据处理 研究数据采用SPSS17软件进行处理 小鼠体重数据以（x±s）表示 P<0.05为差异具有统计学意义。

2 实验结果

2.1 预试验 给予小鼠红花杜鹃下寄生的千斤坠粗提物达最大给药量（11 g/kg）时未观察到小鼠死亡。给予小鼠白花杜鹃下寄生的千斤坠粗提物时观察到小鼠死亡 死亡的最小剂量为12.25 g/kg。

2.2 正式试验

2.2.1 白花杜鹃下千斤坠粗提物LD50测定 小鼠给药后10 min内即发生毒性反应 具体症状如表1所述 持续时间较长 第二天未死亡小鼠精神及活动状态开始好转。死亡情况见表2。经计算 白花杜鹃灌丛下寄生的千斤坠粗提物LD50为15.1 g/kg 95%可信限为12.26～24.20 g/kg。

2.2.2 白花杜鹃下千斤坠粗提物对小鼠体重的影响 小鼠于给药后定量（3 g/只/d）喂食 体重监测14d的统计结果见表3。结果表明 与空白对照组相比 除了第1、2天给予17.15 g/kg的小鼠有减轻外 其余各剂量小鼠的体重无明显差异 说明白花杜鹃下千斤坠对小鼠体重无显著性影响。

2.3 白花杜鹃下千斤坠粗提物对小鼠各脏器组织形态的影响 白花杜鹃下千斤坠对小鼠产生损伤的脏器有心脏、肝脏、肺脏和肾脏。具体病变为：心肌纤维断裂 心肌细胞纤维化 心肌出血、充血并伴有部分炎细胞浸润;肝充血 肝脂肪样变性 肝细胞坏死;肺充血 肺出血 肺泡溶解;肾充血 肾出血 肾小管节段性坏死。组织病变结果如图1所示。

2.4 HPLC图谱对比研究 红、白两种花色杜鹃灌丛下采集的千斤坠植物样品粗提物HPLC分析结果如图2所示。

HPLC研究结果显示 红花杜鹃和白花杜鹃下采集的千斤坠样品的粗提物 在检测波长（225 nm）下显示的主成分吸收峰差异不大。

3 讨论

本项目初步研究结果显示 白花杜鹃灌丛下寄生的千斤坠的粗提物其LD50为15.1 g/kg 介于有毒（LD50为5～15g/kg）和小毒（LD50为16～50 g/kg）之间[10] 据试验现象可判定为有毒 具有致死性 会导致心、肝、肺、肾等脏器出现一定程度病变 需慎重使用。红花杜鹃灌丛下寄生的千斤坠的粗提物在相似剂量时未观察到致死性 说明其安全性稍好[13]。然而 由于两种粗提物之间在试验检测条件下的HPLC主要谱峰近似、未见显著差异 因此 初步推断两种不同花色杜鹃花树下采集的千斤坠样品粗提物毒性方面的差异可能是由毒性成分含量不同引起 或者是毒性成分为在HPLC谱图上不易观察到的某种微量成分 也可能是由于毒性成分在225 nm检测波长处无显著吸收活性 对此有待进一步研究明确。

本研究首次证明了白族医药记录中关于不同来源千斤坠毒性存在差异的相关描述具有一定的可信度 为深入研究与正确使用千斤坠提供了初步的试验依据。千斤坠为白族民间常用植物药 常见泡酒內服或外用。根据本研究结果 若所使用的千斤坠来源不明时 有产生中毒的风险 需要引起注意。特别是由市场购置的千斤坠应以外用为宜 尽量避免盲目内服。

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（收稿日期：2020-09-10 编辑：陶希睿）