柠檬酸发酵液中有机酸含量HPLC 法测定

满 云

（蚌埠学院 食品与生物工程学院，安徽 蚌埠233030）

1 引言

柠檬酸是生物体内主要的代谢产物之一。1913年首次报道黑曲霉能生成柠檬酸，柠檬酸生产的方法由提取法变为发酵法，柠檬酸为三羧酸循环过程中的中间产物［1］（P229-230）。 柠檬酸发酵液中的其他有机酸主要包括谷氨酸、葡萄糖酸、草酸、苹果酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、α-酮戊二酸、丁二酸、富马酸、乌头酸和衣康酸等［2］（P65）。 有机酸含量过多，会影响柠檬酸的纯度，降低柠檬酸转化率。

目前对有机酸含量的检测方法很多［3］［4］（P121）［5-6］，高效液相色谱技术应用于有机酸的含量检测也有很多报道［7-14］，但已有的报道中测定的有机酸品种有限，同时测定多种有机酸的报道不多。 本实验利用高压液相色谱同时测定柠檬酸发酵液中的有机酸，通过选择适合的流动相pH 值、流速、柱温、检测波长等，拟建立准确可靠、简洁快速有效的检测方法，同时分析柠檬酸发酵液中的12 种杂有机酸，以期为柠檬酸发酵工艺的优化提供了理论依据。

2 材料与方法

2.1 供试材料和试剂

柠檬酸发酵液， 中粮生化柠檬酸生产线提供；乙腈（色谱纯），美国Tedia 公司生产；谷氨酸、葡萄糖酸、草酸、苹果酸、丙酮酸、乳酸、乙酸、琥珀酸（丁二酸）、富马酸（延胡索酸）、乌头酸、衣康酸、柠檬酸标准品，百灵威科技有限公司生产。

2.2 仪器与设备

1200 安捷伦色谱仪；Diamonsil C18 （4.6 mm×250 mm）；检测器：PDA 检测器。

2.3 试验方法

2.3.1 标准酸混合液的配制

表1 混合标准液的配制 g/100 mL

因杂酸含量不定，为定量准确，配制多级混合标准液。 标准液采用蒸馏水配制，用0.22 μm 的滤膜过滤。 混合标准如表1 所示。

2.3.2 各种有机酸的定性和定量

（1）定性用各种有机酸的单一标准液分别进样，记下保留时间。

（2）定量用五级混合标准液，做标准曲线定量。

2.3.3 色谱条件

色谱柱 Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm）；流动相为0.1%磷酸溶液∶乙腈=96.5%：3.5%； 流速0.50 mL/min；检测器PDA 检测器；检测波长210 nm；柱温 25 ℃；进样量 10 μL。

2.4 样品前处理

取柠檬酸发酵清液，稀释10 倍，用0.22 μm 的滤膜过滤后进样分析。

3 结果与分析

3.1 色谱分离条件的确定

3.1.1 色谱柱的选择

针对有机酸组系，C18 柱在色谱应用中是应用最为广泛的色谱柱，故选择C18 柱分析。

3.1.2 流动相的选择和配制

（1）磷酸为 0.1%，pH 为 2.0，分离度较好；

（2）用0.1%磷酸与乙腈混合溶液作为流动相，调整磷酸溶液与乙腈的比例分别为90:10、93:7、96:4 和99:1 进行预实验，选好比例范围，再细化流动性配制比例，确定96.5:3.5 为流动相最佳配比。

3.1.3 检测波长的选择

将各种检测用标准酸在200～254 nm 吸光度下进行PDA 扫描，各酸在210 nm 左右均有较大吸收峰，确定适宜检测波长是210 nm。

3.1.4 进样量的选择

用标准有机酸混合液按 5 μL 和10 μL 的进样量进行适宜进样量比较分析，发现 5 μL 进样量时，峰形较小，10 μL 进样量时，峰形适中。

3.1.5 流速的选择

分别以流速 0.4 mL/min、0.5 mL/min、0.6 mL/min、0.7 mL/min、0.8 mL/min、0.9 mL/min 和 1.0 mL/min 进样分析。流速为0.4mL/min、0.5 mL/min 和0.6 mL/min时分离效果较好。 流速高，峰分离度差；流速低，分析时间长， 柱效差。 综合分离度和柱效， 确定0.5 mL/min 流速为最佳流速。

3.1.6 柱温的选择

根据色谱理论［4］，柱温是影响柱效和分离度的主要因素。柱温升高可以降低流动相的粘度和提高树脂的传质效率，但是温度过高，不利于色谱柱的维护；同时，分析时间过短，也不利于分离。 因此，在0.5 mL/min 的流速下， 依次升高柱温至20℃、25℃、30℃和35 ℃时，发现柱温为25 ℃时分离效果较好。

3.2 柠檬酸发酵液中各种有机酸的定性与定量

3.2.1 有机酸的定性

分别用单一标准进样，用保留时间给各有机酸定性（见表 2）。

表2 12 种有机酸标准品保留时间

3.2.2 有机酸的定量

利用外标法对柠檬酸发酵液中的有机酸进行定量。 利用五级混合标准液做标准曲线，以各有机酸对照品质量浓度X 对峰面积进行线性回归，相关性R2均大于0.999，色谱图见图1 和图2。

图1 有机酸混标色谱图

图2 柠檬酸发酵液中有机酸液相色谱图

3.3 重现性和回收率

3.3.1 重现性

将柠檬酸发酵液重复进样5 次，低含量杂酸的重现性如表3。

表3 方法的重现性实验结果

从表3 可以看出，除了富马酸、衣康酸几个痕量数据外，各有机酸含量的相对标准偏差（RSD）在0.32%～4.16%之间，重复性较好。

3.3.2 方法的回收率

在柠檬酸发酵清液中加入各种固体标准酸适量，超声混匀，进行高效液相色谱法测定，加入量和检出量的计算回收率结果如表4。

表4 回收率的统计

从表4 可以看出，有机酸发酵液中各有机酸加标回收率为96.22%~105.00%，方法的准确度较高。

3.4 柠檬酸发酵液中各有机酸含量的测定结果

按照前文样品前处理和色谱分离条件，准备测试样品和设置色谱条件。 测定生产菌（SC）在不同温度条件下的发酵，其他工艺条件相同时，发酵终点液中的有机酸含量测定结果见表5。

表5 不同发酵温度下发酵终点液中有机酸含量 g/100 mL

由表5 可以看出，发酵温度越高，柠檬酸产酸越低， 谷氨酸等其他杂酸越高， 根据每种杂酸的变化趋势， 还可以进一步分析代谢过程的关键控制点。

测定不同菌种在不同温度下的发酵，例如出发菌（CF）和诱变菌（YB），发酵终点液中主要杂酸含量的测定结果见表6。

表6 不同发酵温度下发酵终点液中主要有机酸含量 %

由表6 可以看出，谷氨酸等其他杂酸含量随着温度的升高有明显升高。 同时，经过诱变的耐高温菌株，在高温发酵的时候，谷氨酸等杂酸含量有明显降低。 结果表明，HPLC 分析有机酸的方法，可以为菌种、发酵条件及发酵过程分析提供数据支持。

4 结语

本文采用HPLC 法测定柠檬酸发酵液中的12种有机酸杂质含量， 色谱柱为Diamonsil C18 （4.6 mm ×250 mm）， 流动相为 0.1%磷酸溶液： 乙腈=96.5%∶3.5%， 流速为 0.50 mL/min， 检测器为 PDA检测器，检测波长为210 nm，柱温为25 ℃，进样量为10 μL。 该方法测得的各有机酸相对标准偏差为0.32% ~ 4.16%，加标回收率为96.22% ~ 105.00%。该方法简便快速、选择性好、准确度高，可适用于柠檬酸不同发酵时间点的数据监控，也可用于监控指导柠檬酸后续提纯过程。