青海省门源白牦牛mtDNA D-loop区遗传多样性及母系起源

陈生梅，马志杰，李瑞哲，尕布藏，李文浩，艾德强

(1.青海大学畜牧兽医科学院 青海省高原家畜遗传资源保护与创新利用重点实验室，西宁 810016；2.青海省门源县苏吉滩乡兽医站，门源 810399；3.青海省畜牧总站，西宁 810008)

牦牛是分布在青藏高原及其毗邻高地的特色牛种，中国现有牦牛2200多万头，是世界上拥有牦牛数量和品种(类群)最多的国家[1]。白牦牛主要分布于我国甘肃省天祝县以及青海省门源县、大通县及互助县[2]，是特有的牦牛经济类型和种质资源，享有“草原白珍珠”的美称。线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)D-loop区序列具有丰富的遗传变异，近年来已被广泛用于牦牛的起源、分化及遗传多样性评估等研究[3]。Lai等[4]基于D-loop区和Cyt b基因部分序列对4个中国牦牛品种(包括天祝、九龙、麦洼和西藏高山牦牛)遗传多样性和起源驯化进行分析，表明各牦牛品种具有丰富的遗传多样性，推测中国牦牛起源于同一祖先，可能有2个主要的驯化点。郭松长等[5,6]基于D-loop区部分序列对10个我国家牦牛品种(即天祝、大通和环湖牦牛等)和1个野牦牛群体遗传多样性、分化和聚类关系等进行综合分析，表明野、家牦牛都具有丰富的遗传多样性，但野牦牛遗传多样性较高；牦牛拥有2个聚类簇，推测有2个母系起源；家牦牛品种(类群)间存在显著的遗传分化，但仅存在少数品种(类群)之间；支持将我国家牦牛划分为横断高山型和青藏高原型2大类型的观点。Wang等[7]对包括天祝、甘南和野牦牛等品种(群体)的452头D-loop区以及72头个体mtDNA全序列和蛋白编码序列综合分析表明，野牦牛的遗传多样性高于家牦牛，共检测到3个高度分化的遗传分支，其中2大主要分支在家、野牦牛中都有分布，第3个分支只包含较少野牦牛个体；3大分支分化时间估计在42～58万年；家牦牛分支的非同义突变率显著地高于野牦牛；家牦牛没有明显的谱系地理结构。成述儒等[8]对甘肃6个牦牛群体遗传多样性和聚类关系分析表明，3个群体(即玛曲、碌曲和夏河群体)具有较丰富的遗传多样性，而天祝白牦牛遗传多样性较低，推测甘肃牦牛可能有2个母系起源。Yue等[9]对235头天祝白牦牛D-loop序列进行综合分析，共确定47种单倍型，核苷酸多样度和单倍型多样度分别为0.023±0.001和0.944±0.008，表明天祝白牦牛具有较高的遗传多样性水平。李静等[10]为明确喀喇昆仑—帕米尔地区牦牛的遗传多样性水平、分化和系统进化地位，对该地区156头牦牛D-loop区进行序列测定并与510条已发表的家、野牦牛品种(群体)(包括天祝白牦牛)相应序列进行比对分析，结果显示喀喇昆仑—帕米尔地区牦牛平均单倍型多样度为0.806，核苷酸多样度为0.015，表明该地区牦牛群体遗传多样性丰富；系统发育聚类分析显示其有2大分支，推测其拥有2个不同的母系起源，具有较独特的遗传背景。

从上述研究可以看出，当前基于mtDNA D-loop序列对我国白牦牛母系遗传的研究仅限于天祝白牦牛[4-10]，而对青海省门源白牦牛母系遗传多样性的分子评估研究尚未见报道。鉴于此，本研究对青海省门源县白牦牛的mtDNA D-loop区序列进行测定和比对分析，揭示其母系遗传多样性及其遗传背景，为其种质资源的合理开发和保护利用提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 样品采集及基因组DNA提取

在青海省门源县苏吉滩乡随机采集31头白牦牛的颈静脉血样，EDTA抗凝后带回实验室冷冻保存备用。使用全血基因组DNA提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司提供)提取基因组DNA，操作步骤按说明书进行。用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和纯度，-20℃保存备用。

1.2 引物合成、PCR扩增与测序

采用马志杰等[11]使用的引物来扩增门源白牦牛mtDNA D-loop区序列，其中上游引物(PF)为5'-CTACAGTCTCACCGTCAACC-3'，下游引物(PR)为5'-GGGGTGTAGATGCTTGC-3'，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

PCR反应体系(25 μL): 5×Prime STAR Buffer 5μL，Prime STAR HS DNA Polymerase 0.3 μL，上、下游引物(10pmol/L)各1 μL，基因组DNA1μL，超纯水16.7 μL。PCR反应程序: 98℃变性10s，62℃退火15s，72℃延伸1min，35个循环。PCR产物采用1%琼脂糖凝胶电泳并进行凝胶成像分析，后送PCR纯化产物到上海生工生物工程股份有限公司进行正、反向测序。

1.3 数据分析处理

测序结果采用Bioedit 7.2.5软件[12]进行序列比对及人工校对，以确保测序结果的准确性。用Dnasp 5.10.01软件[13]确定核苷酸序列多态位点和单倍型数目，Arlequin 3.11软件[14]用于计算序列单倍型多样度和核苷酸多样度大小，以揭示门源白牦牛的遗传多样性丰富程度。使用MEGA5.05软件[15]中的邻接法(即NJ法)构建系统发育树开展不同单倍型间的系统发育分析，以揭示其系统发育关系。

2 结果与分析

2.1 门源白牦牛mtDNA D-loop区遗传多样性分析

通过测定31头青海省门源白牦牛mtDNA D-loop区序列，得到序列长度为892～896bp，排除5处插入或缺失位点后共发现38处多态位点(图1)，占分析序列总长度的4.24%。其中，38处多态位点中有24处为单一多态位点，分别为135、142、188、194、256、276、293、309、310、317、326、334、356、391、501、539、694、697、720、731、771、810、813和851位点，占序列总长度的2.68%；14处为简约信息位点(即1、173、230、248、249、257、267、296、314、315、398、495、709和884位点)，占序列总长度的1.56%。序列核苷酸频率统计分析表明，C、T、A和G的平均含量分别为25.36%、28.47%、32.27%和13.90%，C+G的平均含量(39.26%)显著低于A+T的平均含量(60.74%)，表现出明显的碱基组成偏倚性。

图1 门源白牦牛mtDNA D-loop区13种单倍型频率分布及其核苷酸变异

根据序列间核苷酸遗传变异，31头门源白牦牛mtDNA D-loop区序列比对分析共确定了13种单倍型，其中单倍型H2由7个个体共享，单倍型H1和H3均由5个个体共享，单倍型H10由3个个体共享，单倍型H6和H11均由2个个体共享，其余的单倍型均由一个体拥有(图1)。计算分析结果表明，序列平均核苷酸差异数K值为5.17，而单倍型多样度为0.901±0.030，核苷酸多样度为0.006±0.004。

2.2 门源白牦牛系统发育分析

以普通牛(GenBankNo:AF492351)为外群，对13种青海省门源白牦牛mtDNA D-loop区单倍型序列构建系统发育树。如图2所示，13种单倍型在系统发育树中分为明显的2个支系，其中H13单倍型为单独的1支(即支系Ⅱ)，其余12种单倍型聚为另一支(即支系Ⅰ)。

3 讨论与结论

遗传多样性是物种多样性和生态系统多样性的基础，也是生命进化和物种分化的前提，更是评价自然生物资源的重要依据。家畜遗传多样性水平通常以单倍型多样度为主要衡量依据。当前，国内对白牦牛母系遗传多样性的研究主要是针对甘肃省天祝白牦牛品种而开展的。如在先前的研究中，Lai等[4]对13头天祝白牦牛进行D-loop区分析表明，其单倍型多样度为0.923±0.057。郭松长等[5]对23条天祝白牦牛D-loop序列分析得出该品种单倍型多样度为0.930±0.030。成述儒等[8]对40头天祝白牦牛D-loop区的分析表明单倍型多样度为0.662±0.031。而Yue等[9]对235条天祝白牦牛D-loop序列分析显示其单倍型多样度为0.944±0.008。可以看出，甘肃省天祝白牦牛品种的单倍型多样度大小在0.662～0.944之间，其值大小不同可能主要与不同研究者所使用的样本量、采样群体不同及所分析序列的长度不同等因素相关。而在本研究中，青海省门源白牦牛的单倍型多样度大小为0.901±0.030，其值虽小于Yue等[9]基于大样本量计算得出的天祝白牦牛单倍型多样度值，但较接近该值，说明门源白牦牛也具有丰富的母系遗传多样性，但其遗传多样性水平低于天祝白牦牛。就2个白牦牛品种(群体)间的遗传多样性差异缘由，推测可能与其选育程度、群体结构组成、生境环境不同等因素相关，其具体的深层次遗传差异及其原因，有待今后进一步开展深入研究。

图2 基于NJ法构建的门源白牦牛13种mtDNA D-loop区单倍型系统发育树

家畜的起源和系统发育分析有助于揭示不同物种间的遗传差异、进化历史和系统发育关系等，对保护和充分开发利用家畜遗传资源具有重要意义。在先前的研究中，分析表明我国家牦牛具有2个母系起源[4,5,7-10]。在本研究中，聚类分析结果显示青海省门源白牦牛13种单倍型聚为2支，提示其也有2个母系起源，这与前人对其他家牦牛品种(群体)的研究结果一致。

综上所述，本研究表明门源白牦牛具有较丰富的母系遗传多样性，由2个母系遗传分支组成，具有2个母系起源。