聚苯乙烯微球对菜心种子及幼苗的毒性效应

黄献培，向垒，郭静婕，潘一峰，陈逸平，李彦文，莫测辉*

（1.暨南大学生命科学技术学院，广州 510632；2.汕尾市海洋产业研究院，广东 汕尾 516600）

微塑料是指一类粒径小于5 mm 的塑料微粒，在全球环境中被大量检出，其污染及毒性效应已成为全球关注的环境问题和研究热点[1-2]。环境中的塑料垃圾由于风力、水流、光照及生物分解等因素裂解形成小于5 mm甚至纳米级的微塑料[3]，日常护理用品中的纳米级塑料微球也是环境中微塑料的主要来源[4-5]，这些微塑料很难分解，可在环境中存在数百年至几千年[6]。微塑料污染会对生物产生直接毒性效应，造成严重的生态风险[7-8]，同时也会在生物体内积累[9]，并可能通过食物链传递[10-11]，严重威胁人体健康。目前，微塑料的研究主要集中在海洋、河口和沙滩等水域环境以及对水生生物的生态毒性[6，12-14]，发现不同粒径的微塑料对水生生物毒性存在显著差异[14-16]。此外，研究发现微塑料能够降低土壤的微生物生物量、活性及功能多样性，从而影响土壤中营养元素的地球化学循环，进而影响植物种子的萌发及幼苗生长[17-18]。但有关微塑料对陆地及农业生态系统影响的研究仍相对薄弱[2，19]，对陆地高等植物特别是蔬菜作物的直接毒性研究相对较少[9，20]，有关微塑料对植物潜在毒性，特别是不同粒径微塑料对作物的毒性效应亟待进行深入的研究[21]。

蔬菜是人类重要的膳食食品，有关微塑料对叶菜类种子发芽和幼苗生长等方面的研究迄今鲜见报道。聚苯乙烯是使用最为广泛的塑料材料，被大量用于塑料杯、塑料薄膜等包装盒及建筑保温等产业，占全球年度塑料产量的7.1%[22]，已成为土壤、河流、湖泊和海洋的主要污染物[23]。因此，本文采用叶菜类作物十字花科蔬菜菜心（Brassica campestrisL.）作为供试植物，以3种不同粒径（0.07、1 μm和20 μm）的聚苯乙烯微球（PS-MPs）为供试污染物，研究不同粒径PS-MPs在不同浓度下对菜心种子发芽和幼苗生长的影响，旨在探讨微塑料粒径对蔬菜等农作物的毒性效应，为评价微塑料对陆生作物的生态毒性效应提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验材料：供试菜心品种为广泛种植于华南地区的华冠油青60天粗条菜心王，种子购自深圳喜良种子有限公司，发芽率为98%。聚苯乙烯微球（PS-MPs）购自天津市倍思乐色谱技术开发中心，粒径分别为0.07、1 μm和20 μm，规格均为10 mL装微球悬浮液（去离子水），固含量2.5%（m：V），粒径及分散特征见图1。

设备及试剂：无菌玻璃培养皿（直径9 cm）、智能人工气候箱（MGC-300H，上海一恒）、立式压力蒸汽灭菌器（YXQ-LS-100SII，上海博迅）、超纯水系统（Master-Duv，上海和泰）；超声波清洗机（德意生）；30% H2O2溶液（分析纯，成都金山化学试剂有限公司），实验用水均为无菌水（超纯水灭菌待用）。

1.2 实验方法

1.2.1 聚苯乙烯悬浮液（污染溶液）制备

将不同体积的PS-MPs 悬浮液（原液）分别加入无菌水中，超声振荡5 min，使其均匀分散悬浮于无菌水，形成污染溶液备用，实验前再次超声波振荡5 min，确保PS-MPs充分悬浮分散。

1.2.2 预实验

将处理浓度为 125、250、500、1 000、2 000、4 000 mg·L-1和 8 000 mg·L-1的 PS-MPs 悬浮液各 2 mL 分别置于内径为9 cm、铺有滤纸的培养皿中，每个处理3个重复，分别接入经挑选和消毒（10%双氧水中静置10 min，无菌水漂洗3 次）的菜心种子各10 粒，以无菌水作为空白对照（CK）。盖好培养皿并用封口膜密封，置于人工气候箱中25 ℃避光恒温培养，种子露白即认为其发芽[24-25]，当对照组种子发芽率大于90%、根长大于20 mm，实验结束。计算PS-MPs对根伸长、芽伸长及生物量的抑制率为50%和10%的浓度（IC50、IC10），计算公式为（A-B）/A×100%，其中A为对照处理的根伸长、芽伸长或生物量，mm；B为污染处理的根伸长、芽伸长或生物量，mm。

1.2.3 正式实验

根据预实验结果，在PS-MPs 对菜心种子根伸长和芽伸长抑制率10%～50%范围内，设置7 个浓度处理125、250、500、750、1 000、1 500 mg·L-1和2 000 mg·L-1，以无菌水为空白对照（CK），每个处理3 个重复，与预实验相同条件下进行种子发芽实验，实验结束后，测定各处理种子的发芽率、根伸长、芽伸长（以胚轴与根之间的过渡区分根伸长和芽伸长[24-25]）和生物量。计算发芽率、根伸长、芽伸长和生物量的平均值及标准偏差。利用SPSS 20 软件，以浓度-抑制率绘制曲线，进行回归分析，获得最佳拟合回归方程，根据回归方程计算污染物对根伸长、芽伸长和生物量抑制率为10%（IC10）和50%（IC50）的浓度，其中把IC10值作为引起植物受害的阈值（敏感性），其值越小说明污染物越易产生毒害；把IC50值作为评价污染物毒性大小的关键值，其值越小，毒性越大[26]。

1.2.4 可溶性蛋白和可溶性糖含量、酶活性测定

取发芽试验终止后的菜心幼苗，按质量∶体积（g∶mL）=1∶9的比例加入9倍体积的磷酸盐缓冲液（PBS，0.1 mol·L-1，pH 为 7～7.4），制备 10% 或 1% 组织匀浆液，离心（3 500 r·min-1、10 min）后取上清液，用于检测菜心幼苗可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、过氧化氢酶（CAT）活力、超氧化物歧化酶（SOD）活力。试验用试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，实验操作方法参照说明书进行。

1.3 数据分析

采用SPSS 20.0 和Excel 对数据进行相关分析、作图和计算IC10值、IC50值。

2 结果与分析

2.1 PS-MPs对菜心种子发芽率的影响

表1 PS-MPs对菜心种子发芽率的影响（%）Table 1 Effects of PS-MPs on seed germination rates of Brassica campestris L.（%）

不同浓度处理下，3 种粒径PS-MPs对菜心种子发芽率的影响存在差异（表1）。当浓度低于500 mg·L-1时，各粒径PS-MPs对菜心种子发芽率的影响较小，抑制率在10%以内。随着PS-MPs 浓度的增加（＞500 mg·L-1），0.07 μm和20 μm PS-MPs对菜心种子发芽率的抑制作用随之上升，其中后者对菜心种子发芽率抑制作用的IC50值约为1 500 mg·L-1，当浓度增大至2 000 mg·L-1时，菜心种子无法发芽；前者对菜心发芽率的 IC50值则大于 2 000 mg·L-1，其在2 000 mg·L-1时菜心发芽率为66.7%。此结果表明，大粒径PS-MPs对菜心种子发芽的抑制作用强于小粒径PS-MPs。与0.07 μm 和 20 μm PS-MPs 不同，1 μm PS-MPs 浓度即使在500～1 000 mg·L-1浓度范围时，仍对白菜种子发芽率影响较小（＜7%）；当其浓度提升至1 500 mg·L-1时，对菜心种子发芽率的影响显著增强，抑制率达46.7%；其浓度进一步提高至2 000 mg·L-1时，菜心种子无法发芽。结果表明3 种粒径的PS-MPs 对菜心种子发芽率显著抑制的最低浓度大小顺序为1 μm PSMPs（1 500 mg·L-1）＞20 μm PS-MPs（1 000 mg·L-1）＞0.07 μm PS-MPs（500 mg·L-1），即小粒径（0.07 μm）PS-MPs 最易引起菜心种子发芽率的抑制作用，但较大粒径（1 μm和20 μm）产生的毒性作用则较强。

2.2 PS-MPs对菜心种子芽伸长、根伸长和生物量的影响

3种粒径的PS-MPs对菜心种子根伸长、芽伸长及生物量的毒性存在显著的差异，结果如表2和图2所示。不同粒径的PS-MPs对菜心种子根伸长、芽伸长及生物量的毒性均呈现明显的剂量效应，且抑制作用均随着浓度的增加而逐渐提高，呈较好的回归关系（图2），拟合方程的相关系数（R2）均大于0.869（P＜0.05）（表2）。各指标的IC10值最低浓度的大小顺序为：1 μm PS-MPs的芽伸长（165.8 mg·L-1）＞20 μm PS-MPs 的生物量（92.5 mg·L-1）＞0.07 μm PS-MPs 的生物量（11.7 mg·L-1），即 0.07 μm PS-MPs 最易引起菜心种子发芽的抑制作用。IC50值计算结果表明，各粒径PS-MPs对菜心种子发芽抑制作用最大的最低浓度大小顺序为：1 μm PS-MPs的根伸长（705.0 mg·L-1）＞ 0.07 μm PS-MPs的生物量（486.0 mg·L-1）＞ 20 μm PS-MPs 的生物量（354.2 mg·L-1），即20 μm PS-MPs对菜心种子发芽的抑制作用最大。

表2 PS-MPs对菜心种子发芽的影响Table 2 Effects of PS-MPs on seed germination of Brassica campestris L.

2.3 PS-MPs 对菜心幼苗可溶性蛋白和可溶性糖含量的影响

3种粒径PS-MPs处理下，菜心幼苗中可溶性蛋白和可溶性糖含量特征如图3（a）和图3（b）所示，20 μm PS-MPs各浓度处理下，菜心幼苗中可溶性蛋白含量均显著低于对照组（P＜0.05），而可溶性糖含量与对照组相比无显著性差异；0.07 μm PS-MPs 处理组中，污染物浓度低于500 mg·L-1时，菜心幼苗可溶性糖含量高于对照组（P＜0.05），而在750～1 500 mg·L-1时，可溶性蛋白含量显著低于对照组（P＜0.05）；1 μm PS-MPs 处理组中，当污染物浓度高于750 mg·L-1时，菜心可溶性蛋白含量均显著低于对照组（P＜0.05），且随着PS-MPs浓度的增高而逐渐降低；而可溶性糖含量在各处理浓度下与对照组相比均无显著差异。

2.4 PS-MPs对菜心幼苗CAT和SOD活性的影响

3 种粒径PS-MPs 对菜心幼苗抗氧化系统的影响如图4所示，菜心幼苗CAT活性整体呈现随PS-MPs浓度升高而升高的现象，当PS-MPs 低浓度时CAT 活性被抑制效果显著（P＜0.05）；其中20 μm PS-MPs处理组中，污染物浓度低于500 mg·L-1时，菜心幼苗中的CAT活性均显著低于对照组，而 0.07 μm PS-MPs 和 1 μm PS-MPs 处理组中，分别只在低于250 mg·L-1和125 mg·L-1时才具有显著性差异（P＜0.05）。与CAT活性变化趋势截然相反，3 种粒径PS-MPs 处理下，菜心幼苗的SOD活性整体呈现随PS-MPs浓度升高而降低的现象；其中0.07 μm PS-MPs 处理组中，污染物浓度在125～250 mg·L-1和1 000～1 500 mg·L-1时，菜心幼苗中SOD 活性分别显著高于和低于对照组（P＜0.05）；而1 μm 和 20 μm PS-MPs 处理组中，当污染物浓度高于750 mg·L-1时菜心幼苗中SOD活性均显著低于对照组（P＜0.05）。

3 讨论

本研究表明，PS-MPs暴露对菜心种子发芽率、根伸长、芽伸长及生物量均有一定的抑制作用。在PSMPs 浓度小于250 mg·L-1时，菜心种子均能正常发芽，即较低浓度下，各粒径的PS-MPs 对菜心种子的正常发芽影响不显著（P＞0.05）；当 20、1 μm 和 0.07 μm PS-MPs 浓度分别达到1 000、1 500 mg·L-1和500 mg·L-1时，菜心种子的发芽率开始显著降低（P＜0.05），特别是达到最高浓度时（2 000 mg·L-1），20 μm和1 μm PS-MPs处理的菜心种子均不发芽，该结果表明菜心种子对不同粒径的PS-MPs 具有剂量特征效应，受到高浓度PS-MPs 污染时，菜心种子会完全不发芽[27]。

IC10值比较发现，不同粒径PS-MPs 对菜心种子发芽毒性作用的敏感性大小顺序为0.07 μm＞20 μm＞1 μm，表明0.07 μm PS-MPs 最易引起菜心种子发芽毒性效应，这可能是因为粒径较小的PS-MPs（0.07 μm）可以吸附在水分子中，迅速进入植物组织中，阻断细胞间的连接，阻止营养物质的运输，从而迅速地引起细胞毒性[20,28]；20 μm PS-MPs 引起菜心种子发芽的敏感性小于0.07 μm PS-MPs而大于1 μm PS-MPs，可能是粒径较大的PS-MPs（20 μm）团聚包裹在种子表面，堵塞植物细胞壁孔洞，阻碍水分及营养物质的进入，从而抑制菜心种子的发芽和生长[20,29]；1 μm PSMPs 的发芽毒性效应敏感性最小，可能是该粒径的PS-MPs（1.0 μm）难以通过菜心根系细胞间隙的自由空间和质外体屏障进入根系皮层甚至中柱，又无法在种皮外部形成紧密的“屏障”进而极大地阻碍水分等物质的进入[9]。20、1 μm和0.07 μm PS-MPs对菜心种子根伸长、茎伸长和生物量抑制作用的IC50分别为354.2～630.9、705.0～1 238.1 mg·L-1和 486.0～1 337.7 mg·L-1，表明粒径较大的PS-MPs（20 μm）对菜心种子发芽的毒性最大，在较低浓度下即可显著抑制菜心种子发芽生长，这与PS-MPs 对小麦生长特性的影响结果相似，即5 μm PS-MPs 较0.1 μm PS-MPs 对小麦表现出更大的毒性效应[30]。

可溶性蛋白和可溶性糖是生物体内维持细胞渗透势的重要物质，其含量变化与外界对生物生长发育胁迫息息相关[31]。本研究结果发现不同粒径PS-MPs处理下，菜心幼苗体内可溶性蛋白和可溶性糖含量发生了明显的变化，而且，不同粒径处理下，可溶性蛋白和可溶性糖含量的变化趋势也不一致，表明菜心幼苗可以通过调节可溶性蛋白和可溶性糖的含量高低来保持其细胞的渗透势，从而提高其对不同粒径PSMPs 的抗胁迫能力，这也体现PS-MPs 对菜心幼苗毒性作用的粒径效应。其作用机制可能与菜心幼苗对不同粒径PS-MPs 的吸收和转运能力有关，有研究表明，亚微米级甚至微米级的塑料颗粒都可以穿透小麦和生菜根系进入植物体，并能在蒸腾拉力的作用下通过导管系统随水流和营养流进入作物可食用部位[9,28]。同时，塑料颗粒本身也具有一定柔韧性，它们可能在受到挤压力的作用下进入到狭小的根部质外体空间，进一步渗透进入根系皮层组织甚至到达导管组织中，也可以通过新生侧根缝隙而进入根部木质部导管并进一步传输到茎叶组织[32]。

CAT 和SOD 活力的高低间接反映了机体清除氧自由基的能力，它们的值越高，表明受到的胁迫越大[30]。本文研究发现3 种粒径PS-MPs 处理时，除了在0.07 μm PS-MPs 低浓度（≤250 mg·L-1）处理时菜心体内SOD 活性显著升高外；其他处理中菜心幼苗体内CAT 和SOD 活性整体呈现抑制的现象，特别在高浓度处理时（≥1 000 mg·L-1），SOD 活性均显著低于对照组，且呈现随PS-MPs 浓度增高而逐渐降低的趋势。低浓度处理下酶活性的升高可能是菜心幼苗免受外界胁迫毒害的调节反应，而高浓度处理下活性显著下降则表示超出菜心幼苗自身调节能力的阈值，酶活力受到严重的损伤[30]。酶活性试验结果表明PSMPs对菜心幼苗毒性的机制涉及氧化应激系统。

本试验结果表明，3 种粒径（纳米级和微米级）PS-MPs暴露对菜心种子发芽及幼苗生长均产生显著的毒性效应，但不同粒径和浓度PS-MPs 对菜心产生不同毒性生态效应的内在机制有待进一步研究，研究结果为深入了解微塑料对作物发芽、幼苗生长的影响提供了基础数据和科学依据。

4 结论

（1）PS-MPs 对菜心种子发芽存在显著的毒性效应，且表现出一定的粒径效应。

（2）不同粒径PS-MPs 处理对菜心种子根伸长、芽伸长和生物量的影响表现为小粒径（0.07 μm）对毒性敏感性影响最大，但大粒径（20 μm）PS-MPs 对毒性影响更大。

（3）菜心幼苗通过调节体内可溶性蛋白和可溶性糖含量来提高对不同粒径PS-MPs 的抗胁迫能力。同时，PS-MPs 对菜心幼苗的毒性影响机制涉及氧化应激系统。