肠道菌群对慢性荨麻疹患者血清炎症因子的影响

任 媛， 张 敏， 殷 翔， 曾倩雯

[1.陆军特色医学中心（大坪医院）整形外科，重庆 400042；2.陆军军医大学第一附属医院皮肤科，重庆 400038；3.陆军特色医学中心（大坪医院）脊柱外科，重庆 400042；4.陆军特色医学中心（大坪医院）皮肤科，重庆 400042]

荨麻疹是临床常见皮肤病，其特征是出现风疹和/或血管性水肿，分为急性荨麻疹和慢性荨麻疹。急性荨麻疹主要与食物、药物、感染、过敏或拟过敏反应有关；慢性荨麻疹是一种自发性，或可被诱发的疾病，持续时间超过6周。一部分急性荨麻疹可能会转变为慢性荨麻疹。与急性荨麻疹相比，慢性荨麻疹是一种更复杂的疾病，可能与免疫、炎症和凝血失衡有关[1]。目前，关于慢性荨麻疹的研究较多，但其发病机制尚不明确。肠道菌群是一个复杂的生物生态系统，与宿主肠上皮细胞相互作用，并在宿主健康和疾病平衡中起着重要的作用。有研究结果表明，肠道菌群组成和/或活动（营养不良）的紊乱可能是过敏性疾病的发病机制，肠道定植细菌与位于肠上皮和树突状细胞上的Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）反应，可刺激免疫效应细胞的信号通路[2]。短链脂肪酸是肠道微生物通过膳食纤维发酵而产生的，被认为是宿主肠道的重要能量来源，包括乙酸、丙酸和丁酸，这些代谢产物被宿主利用，发挥它们在机体中的作用[3]。有研究者发现，慢性荨麻疹患者血清中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）水平明显高于对照组，表明这些炎症因子在慢性荨麻疹发病机制中有重要作用，并有可能为治疗慢性荨麻疹的新策略提供理论依据[4-5]。本研究通过分析慢性荨麻疹患者肠道菌群、肠道短链脂肪酸、血清TLR4、核因子（nuclear factor，NF）-κB、TNF-α和IL-6水平的关系，探讨慢性荨麻疹患者肠道菌群对血清炎症因子的影响。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2018年1月—2019年8月大坪医院皮肤科收治的慢性荨麻疹患者，同时招募大坪医院体检健康者。所有研究对象排便习惯正常，6个月内未使用抗菌药物、甾体类药物和微生态制剂，未发生过非创伤性感染、过敏、免疫异常疾病、慢性肠胃功能紊乱、胃肠道疾病，近期未进行过手术，无心理和行为学异常[6]。最终纳入慢性荨麻疹患者60例（慢性荨麻疹组），其中男31例、女29例，年龄（43.40±11.75）岁；体检健康者60名（健康对照组），其中男35名、女25名，年龄（45.30±13.92）岁。2个组之间性别、年龄差异均无统计学意义（P>0.05）。本研究经大坪医院伦理委员会审核通过，所有研究对象均知情同意。

1.2 仪器与试剂

IQ5实时荧光定量PCR扩增仪（美国伯乐公司），试剂盒购自日本TaKaRA公司；人粪便细菌DNA提取试剂盒（德国凯杰公司）；去核酸水[天根生化科技（北京）有限公司]。

1.3 方法

1.3.1 样本收集 采用肛拭子收集所有研究对象晨起空腹中段粪便样本，标记姓名及分组后放入液氮罐中速冻，于-80 ℃冰箱保存备用。另采集所有研究对象晨起空腹静脉血，离心收集血清，置于1.5 mL Eppendorf管中，标记姓名及分组，同样置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.3.2 TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-6检测 从-80 ℃冰箱中取出血清，采用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测，严格按照试剂盒说明书要求进行操作。

1.3.3 细菌总DNA提取 从-80 ℃冰箱中取出粪便样本，严格按照细菌DNA提取试剂盒说明书要求进行操作，采用NanoOne微量分光光度计（杭州佑宁仪器有限公司）检测提取的总DNA的纯度和浓度。

1.3.4 目标菌16S rDNA基因检测 采用实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测所有研究对象肠道普拉梭菌、柔嫩梭菌、双歧杆菌和乳酸杆菌。PCR反应体系为25 μL，包括上、下游引物各1 μL、去核酸水8.5 μL、荧光染料12.5 μL、总DNA模板2 μL（60 ng）。反应条件：95 ℃ 3 min；95 ℃15 s；61 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，59 ℃30 s；72 ℃ 30 s，40个循环。普拉梭菌上下游引物分别为5'-GGAGGATTGACCCCTTCAGT-3'、5'-CTGGTCCCGAAGAAACACAT-3'；柔嫩梭菌上、下游引物分别为5'-GCACAAGCAGTG GAGT-3'、5'-CTTCCTCCGTTTTGTCAA-3'；双歧杆菌上、下游引物分别为5'-CTCCTGGAAACG GGTGG-3'、5'-GGTGTTCTTCCCGATATCTA CA-3'；乳酸杆菌上、下游引物分别为5'-CTCGTT GCGGGACTTAA-3'、5'-GCAGCAGTAGGGAAT CTTC-3'[7-8]。

1.3.5 肠道短链脂肪酸测定 精密称取粪便样本0.3 g，预处理后配置乙酸、丙酸和丁酸标准品，采用8860 GC气相色谱仪（美国安捷伦公司）进行检测。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计分析。定性分析采用相对数描述，组间比较采用χ2检验。肠道细菌、短链脂肪酸和TLR4、NF-κB、TNF-α及IL-6水平比较采用两独立样本t检验。采用Logistic回归分析慢性荨麻疹的肠道保护因素。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 慢性荨麻疹组与对照组肠道菌群比较

16S rDNA基因实时荧光定量PCR结果显示，慢性荨麻疹组肠道普拉梭菌、柔嫩梭菌和乳酸杆菌丰度明显少于对照组（t=4.061，P＜0.05；t=3.910，P＜0.05；t=3.858，P＜0.05）。2个组之间肠道双歧杆菌丰度差异无统计学意义（t=-0.175，P>0.05）。见图1。

图1 慢性荨麻疹组与对照组肠道菌群比较

2.2 慢性荨麻疹组与对照组肠道短链脂肪酸比较

与对照组比较，慢性荨麻疹组肠道丁酸含量明显下降（t=4.596，P＜0.05）。乙酸和丙酸含量2个组之间差异均无统计学意义（t=0.560，P>0.05；t=1.797，P>0.05）。见图2。

图2 慢性荨麻疹组与对照组肠道短链脂肪酸水平比较

2.3 慢性荨麻疹与对照组血清TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-6水平比较

与对照组比较，慢性荨麻疹组血清TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-6水平明显上升（t=-12.639，P＜0.05；t=-17.546，P＜0.05；t=-12.132，P＜0.05；t=-5.302，P＜0.05）。见图3。

图3 慢性荨麻疹与对照组血清TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-6水平比较

2.4 慢性荨麻疹组与对照组肠道菌群、短链脂肪酸与血清TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-6的相关性分析

肠道中普拉梭菌、柔嫩梭菌、乳酸杆菌、丁酸与血清TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-6水平均呈负相关（P＜0.05）。见表1。

表1 慢性荨麻疹组与对照组肠道菌群、短链脂肪酸和血清TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-6水平相关性分析

2.5 慢性荨麻疹组与对照组肠道菌群和短链脂肪酸多因素Logistic回归分析

以慢性荨麻疹为因变量，以肠道菌群（普拉梭菌、柔嫩梭菌、双歧杆菌和乳酸杆菌）和短链脂肪酸（乙酸、丙酸和丁酸）为自变量进行多因素Logistic回归分析。结果显示，肠道中普拉梭菌、柔嫩梭菌、乳酸杆菌和丁酸是慢性荨麻疹的保护因素[比值比（odds ratio，OR）值分别为0.124、0.152、0.104、0.738，95%可信区间分别为0.030～0.520、0.033～0.689、0.016～0.698、0.575～0.946]。见表2。

表2 慢性荨麻疹组与对照组肠道菌群、短链脂肪酸多因素Logistic回归分析结果

3 讨论

慢性荨麻疹与全身性炎症相关的免疫反应改变有关，而肠道菌群在免疫调节中发挥着重要的作用。肠道菌群与慢性荨麻疹密切相关，并可能参与慢性荨麻疹的发生、发展。有研究通过年龄和性别进行匹配，招募并检测慢性荨麻疹患者和健康者肠道菌群的变化，结果显示，与健康者比较，慢性荨麻疹患者肠道中的柔嫩梭菌和普拉梭菌水平显著下降，而肠杆菌科细菌水平无变化[9]。有研究发现，慢性荨麻疹患者肠道中的双歧杆菌和乳酸杆菌水平显著降低[10]。66%～93%的慢性荨麻疹患者患有慢性自发性荨麻疹，WANG等[11]通过16SrRNA基因测序分析慢性自发性荨麻疹组和健康对照组肠道菌群，结果显示，与健康对照组比较，慢性自发性荨麻疹组肠道微生物种群的α多样性降低；慢性自发性荨麻疹患者肠道中肠杆菌科细菌丰度增加，而拟杆菌和双歧杆菌的丰度显著降低。本研究发现，与对照组比较，慢性荨麻疹组肠道普拉梭菌、柔嫩梭菌和乳酸杆菌水平明显下降，与文献报道[10]基本一致；而双歧杆菌水平2个组之间无变化，与文献报道[10]不一致，可能与纳入慢性荨麻疹患者时未对疾病发展程度及类型进行进一步分类有关。

普拉梭菌和柔嫩梭菌均属于梭菌Ⅳ簇，在胃肠道中主要产生丁酸，是健康人肠道微生物群中丰富的共生菌之一[12]。肠道中产丁酸盐细菌丰度的降低可减少通过过氧化物酶体增殖物激活的受体γ引起的上皮信号传导，从而增加腔内氧气的生物利用度，导致大肠埃希菌和沙门菌等潜在致病性肠杆菌科细菌的大量增殖[13]。因此，产丁酸盐细菌丰度的降低会减少结肠细胞的重要能源，不利于机体健康。短链脂肪酸包括乙酸、丙酸和丁酸，是肠道细菌发酵产生的代谢产物，其中丁酸是结肠细胞的主要能量底物，可刺激结肠中钠和水的吸收，并对肠道细胞具有营养作用[14]。本研究发现，与对照组相比，慢性荨麻疹组肠道丁酸含量明显下降，与产丁酸盐细菌普拉梭菌和柔嫩梭菌下降一致。说明慢性荨麻疹患者肠道主要产丁酸盐细菌丰度的减少会进一步导致肠道中丁酸含量的降低。

有研究发现，普拉梭菌上清液对葡聚糖硫酸钠诱导的实验性结肠炎小鼠有显著的疾病预防和治疗作用，可能与通过抑制TLR4/NF-κB信号通路，降低TNF-α、IL-6和环氧合酶-2的表达有关[15]。此外，嗜酸乳杆菌KLDS 1.0738可调节肠道菌群，改善β-乳球蛋白致敏小鼠的超敏反应，并伴有TLR4/NF-κB信号表达减少。嗜酸乳杆菌KLDS 1.0738的摄入可能与识别TLR信号传导有关，可抑制变态反应[16]，提示肠道菌群结构的改变及肠道微生物代谢产物可能会影响TLR4/NF-kB信号通路的传导。有研究发现，丁酸可降低肝脏中TLR4的表达[17]。因此，我们推测肠道产丁酸盐细菌丰度的降低会导致丁酸含量降低，从而上调TLR4/NF-κB信号通路的表达，导致炎症因子水平升高。本研究中，慢性荨麻疹患者血清中TLR4和NF-κB水平明显高于健康对照者的结果验证了这一推测。有文献报道动物模型结肠组织中的TLR4/NF-κB信号通路表达下调[15]，与本研究2个组之间血清TLR4和NF-κB水平比较结果基本一致。

激活TLR4/NF-κB信号通路可促进TNF-α和IL-6的分泌[18-19]。本研究结果与其他多项研究结果[20-21]均表明，慢性荨麻疹可能与血清TNF-α和IL-6水平升高有关。慢性荨麻疹患者血清和皮肤组织中的TNF-α表达上调，抗TNF-α治疗可能对这些患者有益。有研究用TNF-α抑制剂阿达木单抗、依那西普或英夫利昔单抗治疗25例慢性荨麻疹患者，其中15例（60%）产生完全反应，包括奥马珠单抗难治性的患者[22]。另有学者用TNF-α抑制剂治疗6例慢性荨麻疹患者后，患者症状得到完全缓解或部分改善[23]，提示TNF-α抑制剂可在一定程度上改善慢性荨麻疹的症状。但抗IL-6疗法是否同样有效还需进一步研究[24]。值得关注的是，通过给予慢性自发性荨麻疹患者每天2次口服2种益生菌（唾液乳杆菌LS01和短双歧杆菌BR03），持续8周，可能会降低一部分慢性自发性荨麻疹患者的症状评分，提高生活质量评分[25]，提示改善肠道菌群可能也是治疗慢性荨麻疹的一个方向。

本研究对慢性荨麻疹患者和健康对照者肠道菌群、短链脂肪酸和血清TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-6进行相关性分析，发现肠道中普拉梭菌、柔嫩梭菌、乳酸杆菌及丁酸与血清TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-6均呈负相关。此外，多因素Logistic回归分析结果显示，肠道中普拉梭菌、柔嫩梭菌、乳酸杆菌和丁酸是慢性荨麻疹的保护因素，提示肠道普拉梭菌、柔嫩梭菌、乳酸杆菌和丁酸水平的升高可降低炎症因子的表达，有益于改善慢性荨麻疹症状。

综上所述，肠道菌群中产丁酸盐细菌的减少可能会降低丁酸的含量，从而上调TLR4/NF-κB信号通路，导致TNF-α和IL-6的表达增加，加剧慢性荨麻疹患者炎症反应和免疫功能失调，但其机制还需进一步研究。