野生小叶黑柴胡种子萌发特性及组织培养研究

史正文

摘    要：为筛选出野生小叶黑柴胡种子的最佳萌发条件，以种子萌发得到的小叶黑柴胡下胚轴为外植体，探讨了不同基础培养基和不同浓度外源性激素在愈伤组织、不定根形成中的作用，以便对野生小叶黑柴胡种质资源的保护提供一定的试验数据和技术支持。

关键词：野生小叶黑柴胡;种子萌发;组织培养

文章编号： 1005-2690（2021）06-0010-02       中国图书分类号： S567.79       文献标志码： B

小叶黑柴胡植株矮小，高仅15～40 cm;根呈黑褐色、小而多分枝，茎丛生;叶窄而小，花呈伞形且花序小，种子小且发芽率低[1]。药理研究表明，小叶黑柴胡性苦、微寒，具有解热、抗病毒、抗炎等作用[2]。小叶黑柴胡主要分布在海拔2 700～3 700 m的地区[3]，由于过度采挖，野生资源逐渐枯竭。采用组培育苗繁殖快，种苗质量高。因此，建立野生小叶黑柴胡组培育苗体系，对其资源保护具有一定的指导意义。

1   材料与方法

1.1   试验材料

当年野生小叶黑柴胡种子，采自山西省宁武县山区。

1.2   试剂

生长素：激动素（KT）、萘乙酸（NAA）、6-苄基氨基嘌呤（6-BA）。

消毒剂：75% Alcohol、0.1% HgCl2、2% NaClO3。

基础培养基：MS和B5培养基，水解酪蛋白（CH）。

1.3   培养条件

以MS和B5为基本培养基，通过改变激素种类和浓度形成不同条件的培养基。pH值6.0～6.5，光照时间12 h/d，光照强度50 μmol/（m2·s），温度（26±2）℃。

1.4   试验方法

1.4.1   小叶黑柴胡种子萌发的条件

1.4.1.1    不同温度下的萌芽试验

取野生小叶黑柴胡种子400粒，每100粒分别在15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃温度下进行发芽试验，逐日记录发芽数，30 d后计算发芽率。本试验重复3次。

1.4.1.2    不同试剂浸种的发芽试验

取小叶黑柴胡种子200粒，每100粒分别用3% H2O2、1.0 mg/L GA3浸种1 d，再用流水洗净。逐日记录发芽数，30 d后计算发芽率。

1.4.2   小叶黑柴胡愈伤组织及不定芽的诱导

1.4.2.1    试验材料的消毒

取实验室培养出的小叶黑柴胡幼苗，分别用75% Alcohol、0.1% HgCl2、2% NaClO3 消毒剂浸泡，筛选最佳的消毒条件。

1.4.2.2    愈伤组织诱导培养基的筛选

将消毒后的幼苗，用无菌水冲洗3次，选取下胚轴，切成1 cm小段接种于不同激素配比的MS或B5基本培养基表面。

试验中每30 d继代1次，统计愈伤组织的诱导率，记录愈伤组织的颜色、质地及生长状况。最后根据数据分析，筛选出最佳的愈伤组织诱导培养基。

1.4.2.3    不定芽诱导培养基的筛选

将下胚轴生成的愈伤组织取出，用灭菌解剖刀切成小块，无菌水冲洗干净，然后接入含有不同浓度的激素和水解酪蛋白CH的MS或B5基本培养基表面，30 d后统计不定芽的诱导率。

2   结果与分析

2.1   小叶黑柴胡种子的萌发条件筛选

对于柴胡种子发芽率低的原因，魏建和等[4]曾报道，柴胡种子萌发率低与种皮和种子的成熟度有关。本试验采取不同温度及不同化学试剂对野生小叶黑柴胡种子进行预处理，探讨了小叶黑柴胡种子的发芽条件，结果见表1和表2。

由表1和表2可以看出，用3%H2O2浸种1 d，能使小葉黑柴胡种子的发芽率显著提高，而1.0 mg/L GA3对小叶黑柴胡种子的发芽有抑制作用。小叶黑柴胡种子发芽的最适温度为20 ℃，其中15～20 ℃时的发芽率要高于25～30 ℃，说明小叶黑柴胡种子发芽喜低温。

2.2   灭菌方法的比较

组培育苗中首先要解决的问题是污染，如果不能控制污染，组培育苗就失去了意义。因此，探索外植体的最佳消毒条件是小叶黑柴胡组织培养的前提。本次试验比较了4种消毒方法，选择出了杀伤力较小且效果好的消毒方案。接种10 d后，4种不同消毒方案的效果见表3。

由表3可以看出，用方案3和4消毒，灭菌效果虽然好，但对外植体的损害也大，获得的无菌试验材料存活率也低。因此，在选择消毒剂时，既要考虑能杀死附着在外植体表面的微生物，又要尽量不伤害植物组织细胞。用方案1消毒，存活率高，但污染率也很高;而用方案2消毒，污染率很低，同时存活率也很高。所以，小叶黑柴胡的最佳消毒条件是75% Alcohol溶液中荡涤30 s，无菌水荡涤后，用0.1% HgCl2溶液荡涤2.5 min，无菌水荡涤后，再用2% NaClO3溶液荡涤10 min。

2.3   愈伤组织诱导条件

由表4可知，不同基础培养基、不同浓度外源性激素对小叶黑柴胡下胚轴愈伤组织诱导结果不同。整体来看，培养7 d后，野生小叶黑柴胡下胚轴开始形成愈伤组织。其中，MS基础培养基诱导愈伤组织的效果优于B5基础培养基，0.1 mg/L KT的诱导效果优于0.5 mg/L KT。2，4-D是柴胡组织愈伤组织诱导的主要激素，在MS+1.0 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L KT的培养基上，下胚轴愈伤组织的诱导率达到100%，并且生长状态良好。

2.4   不定芽的诱导条件

在分化培养基中培养30 d左右，下胚轴愈伤组织块上开始分化出芽，且分化出芽的数量逐天增加，具体结果见表5。

由表5可以看出，在B5基础培养基中加入一定量的6-BA、NAA和CH，有利于小叶黑柴胡下胚轴愈伤组织分化芽，并且1.5 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA+250 mg/L CH的B5培养基分化率最高。

3   讨论

试验表明，下胚轴愈伤组织诱导的最适培养基是：MS为基本培养基，添加的激素及浓度分别为1.0 mg/L 2，4-D、0.1 mg/L KT。不定芽分化的最适培养基是：B5为基础培养基，添加的激素及浓度分别为1.5 mg/L 6-BA、0.02 mg/L NAA、250 mg/L CH。

组培育苗时，外植体的采集会受时间、种植地点的限制，尤其是超过了适宜采集期，外植体培养的愈伤组织质量就会受到影响。因此，本试验采集当年野生小叶黑柴胡饱满、无病虫害的种子。组培试验中，外植体消毒效果的好坏会影响组培育苗的成活率。首先，在实验室探索其种子发芽的适宜条件，提高了其种子的发芽率。其次，在温室中种植，得到其幼苗，为下一步的组培育苗提供了优良的外植体。本试验筛选出了野生小叶黑柴胡外植体的最佳消毒方法，保障了后续组培育苗的成功。本试验选用小叶黑柴胡的下胚轴作为组培育苗的外植体，由下胚轴形成的愈伤组织颜色为浅绿色，质地松软，生长良好，并且分化能力强，提高了组培育苗的效率。

参考文献：

[ 1 ] 胡双丰.柴胡与其混淆品小叶黑柴胡及锥叶黑柴胡的鉴别[J].药学实践杂志，2006，24（4）：47-48.

[ 2 ] 国家中医药管理局中华本草编委会.中华本草[M].上海：上海科学技术出版社，1999.

[ 3 ] 王玉庆，牛颜冰，秦雪梅.野生柴胡资源调查[J].山西农业大学学报（自然科学版），2007，27（1）：103-107.

[ 4 ] 魏建和，李昆同，程惠珍.种子成熟度及种皮对北柴胡和三岛柴胡种子萌发的影响[J].中国中药杂志，2003，31（5）：46-48.