小鼠脑外伤后脑血流的动态变化及其与行为学恢复的相关性

李坤航，张旭东，赵丹，梁宇，钟诗雨，赵伟东，包义君

（中国医科大学 1.附属第四医院神经外科，沈阳 110032；2.生命科学学院发育细胞生物学教研室，沈阳 110122）

创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）是世界范围内最主要的致死和致残原因［1］。在中国，每10万人中有13人因脑损伤而死亡［2］。TBI显著增加其他神经系统疾病风险，包括慢性创伤性脑病、阿尔茨海默病和抑郁等［3］，从而带来巨大社会压力和经济损失［2］。脑血管损伤是TBI重要的病理生理过程，脑血管结构破坏、功能障碍参与了TBI的发病、发展及损伤修复过程，并与继发性损伤密切相关。血管功能障碍常表现为脑出血、脑梗死、脑水肿等［4］。脑血流是评估血管功能的重要指标之一，大多数TBI患者在受伤后可以观察到局部或整体的脑血流减少，进一步导致缺血性脑损伤，这是TBI后死亡的主要原因［5］。但是，关于脑血流的恢复及其与运动功能的相关性研究很少。轻中度脑损伤后，脑血流通常会几周内恢复正常［4］，早期干预和合理调节脑血流可能会改善TBI患者的预后。

本研究旨在明确TBI后脑血流的动态变化过程，探讨脑血流变化与运动功能的相关性，为通过调节脑血流改善TBI患者的预后提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用84只12 h/12 h光/暗饲养的成年雄性C57BL/6野生型小鼠，体质量25～30 g，12周龄（辽宁长生生物科技有限公司）。所有实验在中国医科大学实验动物管理监督下，符合动物福利和伦理准则。将小鼠随机分为Sham组和TBI组，每组42只。实验过程中无小鼠死亡，实验后给予小鼠安乐死。

1.2 方法

1.2.1 控制性皮质撞击（controlled cortical impact，CCI）损伤模型建立：采用CCI设备［6］（Pinpoint 精确皮层撞击器PCI3000，美国Hatteras 公司）构建TBI模型。CCI具有较强的可操作性和较高的准确性，可控制撞击参数（撞击速度、撞击深度和停留时间）以获得不同程度脑损伤，并通过评估小鼠神经功能和脑损伤深度判定TBI程度。TBI后小鼠神经功能轻度下降而无脑组织结构改变为轻度；TBI后小鼠神经功能明显下降且脑损伤仅累及皮层未伤及海马为中度；TBI后小鼠神经功能明显下降且脑损伤累及海马或更深层脑组织为重度［7］。

小鼠用异氟烷麻醉后，将其头部固定在立体定位架中，恒温加热垫维持体温。术区消毒后，在头皮上做一个长约10 mm的正中切口，剥离皮肤和骨膜，在右顶骨上，以矢状缝右侧和冠状缝后侧3 mm处为中心，用颅钻钻开直径4 mm的圆形骨窗（图1A）。TBI组小鼠在接受开颅手术后，选择直径3 mm的圆形钢制平头撞击器，撞击器接触硬脑膜后（图1B），以1.5 m/s的撞击速度、1.0 mm的撞击深度垂直撞击脑皮层，撞击后停留50 ms。缝合皮肤，唤醒小鼠。Sham组小鼠只接受开颅手术，不进行撞击。

1.2.2 激光散斑成像：使用激光散斑血流成像系统［8］（SIM BFI-HR，PRO迅微光电科技有限公司）测量脑血流量。分别于TBI前和TBI后6 h、1 d、3 d、7 d、14 d、35 d对造模成功的小鼠进行激光散斑成像。成像在恒温麻醉下进行，剪开前期缝合皮肤，暴露颅骨并清洗。在图像采集过程中，使用无菌棉保持曝光区域清洁干燥。在可见光下调整CCD摄像机焦距以获得清晰图像，之后转换到785 nm激光状态下采集脑血流信号，用LSCI软件（SIM BFI软件，光电科技有限公司）转换成脑血流图像。每隔1 s采集1张图像，共采集20幅图像。通过LSCI软件对采集的脑血流图像进行分析，在小鼠脑左右对称的固定位置，选取面积50 mm2圆形观察区域，LSCI软件自动计算并生成观察区域平均血流指数（blood flow index，BFI）。通过计算损伤侧和损伤对侧脑血流的相对变化分析TBI后脑血流的动态改变，脑血流相对变化的计算公式：脑血流相对变化（%）=（损伤侧BFI-对侧BFI）/对侧BFI×100。

1.2.3 转棒实验：采用转棒实验评估小鼠运动协调性（ZB-200，成都泰盟软件有限公司）。首先在TBI前第3天开始对小鼠进行转棒训练，训练3 d，每天训练3次，每次训练间隔为10 min，转棒速度为20 r/min，使小鼠在300 s内基本能够随转棒做相应运动，避免在转棒上失去平衡而掉落。以TBI前第1天跌落时间为基线。然后分别于TBI后第1、3、5、7、10、14、21、28、35天进行实验，在20 r/min转棒速度下记录小鼠跌落时间，未跌落最长实验时间设为300 s，每次实验进行3次，间隔10 min，将3次跌落时间均值记录为每次跌落时间。

1.2.4 悬绳实验：将小鼠以悬臂状态放在长30 cm、直径2 mm的悬绳上，然后被释放。每只小鼠测试3次，根据缺陷严重程度进行评分（0～3分）。小鼠立即从悬绳掉落，记为3分；2只前爪都挂在绳子上，试图爬到绳子上，记为2分；2只前爪和1只或2只后爪都在绳子周围，记为1分；4只爪子和尾巴在绳子周围，有横向移动，记为0分。

1.2.5 壁架实验：将小鼠放在高35 cm、宽0.8 cm的笼子壁架上，监测其运动情况。每只小鼠测试3次，根据缺陷严重程度进行评分（0～3分）。小鼠从壁架上摔下来或拒绝行走，记为3分；小鼠没有立即有效地在壁架上行走或从壁架上下来，记为2分；小鼠在壁架上行走时表现出脚部障碍，记为1分；小鼠沿着壁架行走，没有脚部障碍（即松脚），然后小心翼翼地回到笼子里，记为0分。

1.3 统计学分析

采用GraphPad Prism 7.0软件进行统计学分析。所有数值均以表示，2组比较采用两独立样本t检验，P＜ 0.05为差异有统计学意义。采用SPSS 21.0软件进行Pearson相关分析和曲线拟合。

2 结果

2.1 小鼠中度TBI模型的构建

TBI造模（图1A、1B）后，脑组织出现出血和挫裂伤等表现（图1C）。通过脑组织冠状切片评估脑损伤区域，确认脑损伤仅局限于皮层未伤及海马（图1D），达到中度TBI模型标准。

图1 构建小鼠中度TBI模型Fig.1 Establishment of a mouse model of moderate traumatic brain injury（TBI）

2.2 TBI后脑血流的动态变化

通过激光散斑技术量化TBI后局部脑血流变化，分别在小鼠脑左右对称固定位置选取感兴趣区域进行数据采集（图2A）。结果发现，在TBI急性期损伤区域脑血流显著减少，TBI后6 h、1 d、3 d脑血流分别减少了69.8%、62.9%、67.8%（图2B、2C）。TBI后3 d脑血流开始恢复，TBI后7 d脑血流虽然有所恢复，但仍减少了45.2%，直至TBI后14 d基本恢复到正常水平（图2B、2C）。

图2 TBI后脑血流的动态变化Fig.2 Dynamic changes in cerebral blood flow（CBF）after traumatic brain injury（TBI）

2.3 TBI后小鼠运动行为学的变化

转棒实验结果表明，TBI导致运动障碍，TBI后小鼠转棒时间明显下降至14.3 s，TBI后3 d下降至最低点13.5 s，之后运动能力逐渐恢复，TBI后5 d、7 d、10 d、14 d、21 d分别为79.6 s、141.4 s、193.8 s、263.0 s、286.0 s，直至TBI后28 d运动协调能力恢复正常（图3A）。悬绳实验结果表明，TBI后1 d评分显著增加，提示前肢肌力明显受损，TBI后14 d受损肌力大部分恢复。壁架实验也得到相似结果，TBI后评分显著增加，提示四肢协调能力下降，并于TBI后14 d基本恢复正常（图3B）。

图3 TBI后运动功能的变化Fig.3 Impaired motor function after traumatic brain injury（TBI）

2.4 TBI后脑血流动态恢复与行为学变化的相关性

Pearson相关分析结果表明，TBI后小鼠脑血流动态恢复和行为能力恢复呈显著正相关（r=0.984，P＜ 0.01）。TBI后当脑血流减少时，小鼠行为能力下降；当脑血流恢复时，小鼠行为能力也逐渐改善（图4A）。以小鼠转棒实验中跌落时间改变量百分比为因变量（Y），以脑血流改变量百分比为自变量（X），绘制散点图（图4B），根据图形趋势再进行Pearson直线相关分析，发现2组变量呈线性相关（F=124，P=0.000 4）。Pearson直线回归方程初步建立为Y=1.307X-5.744。

图4 TBI后脑血流变化和行为能力变化的相关性分析Fig.4 Correlation analysis of cerebral blood flow（CBF）and motor function after traumatic brain injury（TBI）

3 讨论

TBI常导致脑血管出现结构损伤，继而诱发血管痉挛、闭塞等改变，从而影响脑血流，脑血流变化后出现脑缺血、出血、外渗等现象，这些继发性改变会再次影响脑血流。无论是原发性还是继发性脑血流变化，都会导致脑损伤，引起神经功能障碍［4，9］。TBI后，脑组织损伤大小、位置、类型以及损伤时间都会影响脑血流变化的形式和程度［9］。HAYWARD等［10］发现，患者遭受中度或重度TBI后，脑血流出现严重障碍，随后缓慢恢复到生理水平。他们还通过灌注加权磁共振成像发现大鼠TBI后6 h同侧皮质脑血流减少，随后24 h脑血流增加，TBI后2～14 d脑血流长期下降。在小鼠TBI模型中也观察到相似现象。ABRAHAMSON等［11］通过CCI模型发现，小鼠TBI后3周内皮质挫伤区脑血流一直保持低灌注状态；而丘脑血流在TBI后3 d开始恢复，在TBI后3周基本恢复至正常水平；海马区血流在TBI后无明显改变。然而，以往研究无论是在患者还是在动物模型中，均是对几个孤立时间点的脑血流检测。而本研究首次持续动态监测小鼠TBI后脑血流变化，即TBI急性期局部脑血流显著下降，减少了60%～70%，TBI后6 h下降程度最大，减少了69.8%。TBI后3 d脑血流逐渐恢复，TBI后7 d仍呈低灌注状态，至14 d恢复至正常水平。本研究构建了小鼠脑额叶运动区皮层中度TBI模型，完整记录TBI后超急性期（TBI后6 h）、急性期（TBI后3 d）、亚急性期（TBI后3周）及恢复期脑血流从减少到恢复的实时动态变化全过程。本研究的连续性血流分析更有利于指导后期脑血流调节治疗，为后期临床应用奠定基础。

脑血流的平衡与稳定是维持正常神经功能的前提，脑血流改变会引起神经功能障碍。LEISTNER等［12］在对中风儿童的研究中发现，中风患者重要组织中脑血流明显低于同龄人。与非偏瘫患者相比，偏瘫患者脑血流灌注不平衡，特别是在运动区。INOUE等［13］发现，重度TBI患者中脑血流恢复好的患者，其神经功能状态预后要明显好于脑血流无明显恢复者。JING等［6］发现，TBI导致小鼠在急性期病变部位脑血流减少，然后逐渐恢复，至TBI后28 d恢复至正常水平，随后神经认知功能改善。本研究发现，脑血流与运动功能恢复呈显著正相关。TBI导致小鼠运动协调能力显著下降，尤其在TBI后3 d最差，与脑血流在TBI后3 d略有下降相对应，随着脑血流恢复而逐渐改善。本研究发现，当脑血流在TBI后14 d已恢复到正常水平时，运动功能仍存在缺陷，直到TBI后28 d恢复到正常水平，这说明脑血流恢复早于运动功能恢复，提示脑血流恢复是神经功能恢复的前提与保障。本研究首次提出脑血流恢复是运动功能恢复的必要条件，所以早期选择适当时间点通过高压氧或药物等干预因素促进脑血流恢复可能会改善TBI神经功能恢复。

本研究建立的TBI模型模拟的是中等程度的TBI，在其他不同程度（如轻度和重度）的TBI模型中，脑血流和运动功能变化的相关性是否与本研究一致，有待于进一步研究。

综上所述，TBI可导致脑血流下降和运动功能障碍，随后脑血流和运动功能逐渐恢复，二者的恢复呈显著正相关，且脑血流的恢复早于运动功能的恢复。本研究结果表明，临床工作中可通过TBI患者脑血流恢复情况提早预测运动功能恢复情况；同时，采取措施促进脑血流恢复，可能会促进患者运动功能的恢复。