松科植物萜类合成酶及其基因家族研究进展

朱沛煌，陈 妤，季孔庶

(南京林业大学，南方现代林业协同创新中心，林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室，江苏 南京 210037)

萜类化合物(terpenoids)是一类结构极为丰富的天然产物，目前已在细菌、真菌、昆虫以及植物等生命体中发现8万余种天然萜类化合物及其衍生物[1-5]。萜类是植物合成种类最多的一类代谢物，少部分萜类作为植物生长发育所需的初级代谢物发挥生理作用，如赤霉素、脱落酸、类胡萝卜素和叶绿素等[6]；绝大多数萜类作为植物的次生代谢产物，在植物适应环境、传递信息和化学防御等生命过程中发挥重要作用，例如一些挥发性萜类作为花香产生的主要物质能够吸引授粉生物，有些具有毒性的萜类可以作为植物毒素来防御食草动物、有害昆虫和病原微生物等，某些萜类还具有介导植物与周围生物和非生物因素相互作用的生态功能[7-9]。植物萜类化合物在人类社会中也具有重要的价值，例如马尾松(Pinusmassoniana)、湿地松(P.elliottii)等针叶树产生的松脂中含有大量的单萜和二萜，可以用来提取松节油和松香应用于化工和生物燃料等领域[10]，一些特殊的萜类化合物具有重要的药用功能，如紫杉醇、雷公藤素以及青蒿素等[11-13]。

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但由于不同主体在回应乡村问题时采取不同的策略，差异化的乡建模式有各自的优点和运用局限（表2）。乡建没有统一的模板，应基于不同村庄的自然、社会、经济、文化背景，从而探索出适应自身发展的道路[19，20]。任何一种乡村实践，都不可能面面俱到，需要分清主次、懂得取舍，在传承过去、践行现在、发展未来之间取得平衡

松科(Pinaceae)是裸子植物(gymnosperms)中最大的科，有10属约230种，我国有10属约113种。松科植物是重要的纸浆、实木用材树种，多数是重要的绿化造林树种，有些可采割松脂用于提取松节油与松脂，具有重要的生态与经济价值[14-15]。萜类化合物结构多样性的形成主要依赖萜类合成酶(terpene synthases，TPSs)[16]，近年来以基因组学技术为代表的生物技术发展迅速促进了松科植物萜类合成酶基因家族成员的发现和研究。本研究重点介绍近年松科植物萜类合成酶及其基因家族的研究进展，以期为松科植物萜类化合物生物合成分子机制的完善和国内松科植物的相关遗传改良提供理论依据和技术支持。

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1 植物萜类化合物前体的合成及其关键酶基因

TPS-a、TPS-b和TPS-g这3个亚家族在系统发育上与其他4个亚家族有较大差异，其中绝大部分基因都是被子植物中与次生代谢相关的单萜合成酶、倍半萜合成酶或者二萜合成酶基因。其中基因数量最多的是TPS-a亚家族，大多数都是倍半萜合成酶基因，几乎占到被子植物萜类合成酶总数的一半，并且又可根据单/双子叶植物分成TPS-a1和TPS-a2组[16]。TPS-b亚家族大多是环状单萜合成酶基因和异戊烯基转移酶基因，绝大多数TPS-b基因分布在双子叶植物中，但在单子叶植物高粱(Sorghumbicolor)中也发现过TPS-b基因[62]。TPS-g亚家族基因缺失“RR(X)8W”基序，包含单萜合成酶、倍半萜合成酶以及二萜合成酶，但产物几乎都是非环状萜类[16]。

图1 植物萜类合成途径(据文献[61, 66]整理)Fig.1 Terpenoids biosynthesis pathways in plants(adapted from [61, 66])

2 植物萜类合成酶的结构和类型

植物萜类合成酶基因家族大小不等，除小立碗藓较为特别，从其基因组中只鉴定出1个有功能的萜类合成酶基因，其他植物基因组中鉴定到的萜类合成酶基因(含假基因)数量为18～172[32,38,48]。被子植物中已经报道可能有功能的植物萜类合成酶基因家族有拟南芥32个[49]、巨桉(Eucalyptusgrandis)113个[48]、葡萄(Vitisvinifera)69个[44]、毛果杨(Populustrichocarpa)38个[50]、番茄(Lycopersiconesculentum)29个[51]、凤梨(Ananascomosus)21个[52]以及水稻(Oryzasativa)32个[16]等。被子植物基因组中有相当数量的萜类合成酶基因在较短的基因组区域中串联排列，通常这些串联基因都具有较高的同源性，例如葡萄中有85%的萜类合成酶在基因组中是串联的，其18号染色体上有45个萜类合成酶基因串联出现在1个690 kb的基因簇中[44]；而水稻也有66%的萜类合成酶基因在基因组中串排列，其4号染色体的1个480 kb的基因簇上发现了14个萜类合成酶基因[16]。植物萜类合成酶高度串联和较高同源性的情况，可能是其进化过程中发生基因复制事件的证据之一。

左图为大冷杉(Abies grandis)二萜合成酶AgAS晶体结构[28]。The crystal structure of diterpene synthase AgAS from Abies grandis is shown on the left[28].图2 植物萜类合成酶结构Fig.2 The structure of terpene synthases in plants

Class I型酶的催化活性位点位于蛋白质C端的α结构域，具有1个高度保守并富含天冬氨酸的活性位点基序“DDXXD”，同一个结构域中还包含1个保守程度不高的“NSE/DTE”基序，这两个基序位于活性中心袋口的两个反向螺旋上。Class Ⅰ型萜类合成酶包括了所有的单萜合成酶与倍半萜合成酶，以及部分二萜合成酶[5,29](图2)。Class I型萜类合成酶α结构域的两个基序能够结合3个Mg2+，并通过Mg2+与异戊烯基二磷酸底物的二磷酸(PPi)基团作用帮助底物进入活性中心，然后PPi基团离子化从底物分子上发生裂解，生成高度活化的碳正离子中间体并发生环化反应[30]。

Class Ⅱ活性位点位于蛋白质N端的β结构域，含有1个保守的活性位点基序“DXDD”。Class Ⅱ型的萜类合成酶只包括部分二萜合成酶，更接近N端的γ结构域含有1个富含酸性氨基酸的“EDXXD”基序，可以提高Class Ⅱ活性位点的催化活性[1](图2)。Class Ⅱ型萜类合成酶中“DXDD”活性位点可以促使异戊烯基二磷酸底物中的双键质子化，从而形成碳正离子中间体，再进一步发生多步连续环化，并终止于质子消除反应[1,31]。而Class Ⅰ/Ⅱ型酶拥有“EDXXD”、“DXDD”和“DDXXD”这3个活性基序。Class Ⅰ型和Class Ⅱ型两种类型的萜类合成酶活性中心催化碳正离子中间体形成的机制不同，Class Ⅱ型酶通过催化底物质子化引发碳正离子中间体形成，而Class Ⅰ型酶通过催化PPi基团电离形成碳正离子中间体。

大部分单萜和二萜的直接前体GPP和GGPP在质体中合成，而倍半萜直接前体FPP在胞质中合成，因而大多数单萜/二萜合成酶与倍半萜合成酶在细胞内的定位不同。质体定位的单萜/二萜合成酶蛋白质N端具有质体信号肽[36](图2)。有研究认为信号肽从N端“RRX8W”基序中的切除与否对单萜合成酶的催化活性有显著影响[37]。

有学者在江南卷柏(Selaginellamoellendorffii)基因组中发现1种新型的类微生物萜类合成酶(microbial-like terpene synthases，MTPSLs)基因，其更接近微生物萜类合成酶基因，基因内含子数目、蛋白质结构域数目与典型的植物萜类合成酶基因差异较大。类微生物萜类合成酶编码酶蛋白除了Class I型酶中典型的“DDXXD”基序，在其1级结构中还发现了“DDXXXD”和“DDXXX”基序[32]。近年来在更多古老非种子陆地植物，如地钱(Marchantiapolymorpha)、角苔(Anthocerospunctatus)、岩蕨(Woodsiailvensis)和三叶粉叶蕨(Pityrogrammatrifoliata)等中发现了微生物型萜类合成酶基因[33-35]。

有学者认为小立碗藓(Physcomitriumpatens)唯一的双功能Class Ⅰ/Ⅱ型二萜合成酶柯巴基焦磷酸合酶/贝壳杉烯合成酶(copalyl diphosphate synthase/ kaurene synthase，CPS/KS)可能是植物萜类合成酶的祖先基因，并且认为植物萜类合成酶祖先基因出现于裸子植物与被子植物分化之前[38-41]。有学者进一步提出细菌、真菌和植物间可能有一个共同的二萜合成酶祖先基因[42]。根据已经报道的植物萜类合成酶晶体结构[28,31]，发现了某些γ结构域缺失或者γ、β、α结构域保留但缺少Class Ⅰ或Class Ⅱ活性的萜类合成酶[43]，以及一些具有催化C10/C15或C15/C20混合底物能力的萜类合成酶[44-45]等研究证据，推测最早由两个分别具有γ、β结构域和α结构域的祖先基因融合产生了具有γ、β、α结构的祖先萜类合成酶基因，在其后进化过程中经历了γ结构域对应基因丢失事件形成β、α结构的萜类合成酶基因，并且随着信号肽与结合底物能力的改变逐渐形成了现有植物单萜合成酶、倍半萜合成酶和二萜合成酶基因等的植物萜类合成酶基因家族[20,46-47]。序列分析表明裸子植物和被子植物中的二萜合成酶柯巴基焦磷酸合酶和贝壳杉烯合成酶基因可能都是从祖先CPS/KS基因复制获得，而CPS和KS酶的亚功能化分离可能是2个祖先复制基因突变导致其编码酶蛋白中的1个结构域(Class Ⅰ或Class Ⅱ)活性丧失形成的[16]。

3 萜类合成酶基因家族的鉴定与系统分类及其在松科植物中的特点

植物萜类合成酶蛋白由模块化的3个相对保守的α螺旋结构域(γ、β和α)组成，几乎所有萜类合成酶都包含β和α结构域，部分倍半萜合成酶与绝大多数二萜合成酶含有γ结构域[5,27-28](图2)。植物萜类合成酶1级结构中发现了两个活性位点基序(Class Ⅰ和Class Ⅱ)，根据含其中1个或2个活性位点基序，可以将萜类合成酶划分为Class Ⅰ型、Class Ⅱ型或Class Ⅰ/Ⅱ型[16,27-28](图2)。

松科植物由于基因组巨大，造成基因组测序组装工作较其他植物有更大难度，近年来仅报道有白云杉(Piceaglauca，20.8 Gb)[53-54]、挪威云杉(P.excelsa，19.6 Gb)[55]与火炬松(P.taeda，22 Gb)[56-57]全基因组草图。Warren等[53]从白云杉基因组中鉴定了83个萜类合成酶基因，包括55个可能有功能的萜类合成酶基因以及28个假基因，陈小娥[58]从火炬松基因组中鉴定了68个萜类合成酶基因，为其他松科植物萜类合成酶基因数量提供了参考。Keeling等[59]与Celedon等[60]分析云杉转录组中萜类合成酶转录本信息，结果表明云杉个体中可能有超过60个不同的萜类合成酶转录本。

根据对已有植物萜类合成酶基因家族进行系统进化分析，通常可将植物萜类合成酶基因分为7个基因亚家族，即TPS-a、TPS-b、TPS-c、TPS-d、TPS-e/f、TPS-g 和TPS-h，其中TPS-a、TPS-b和TPS-g是被子植物特有的亚家族，TPS-d是裸子植物特有的亚家族，TPS-c和TPS-e/f是被子植物与裸子植物所共有的亚家族，而TPS-h亚家族的萜类合成酶基因仅在江南卷柏中发现[16,32](表1)。

表1 植物萜类合成酶基因亚家族的成员分布、结构与功能(根据文献[16, 61]整理)

萜类化合物由2个或2个以上的5碳异戊二烯单元首尾拼接而成，根据5碳异戊二烯单元的数目可将萜类分成单萜(C10)、倍半萜(C15)、二萜(C20)、三萜(C30)以及多萜等[6]。植物细胞内用于生产萜类物质的5碳异戊二烯前体的异戊烯基二磷酸(isopentenyl pyrophosphate，IPP)和二甲丙烯二磷酸(dimethylally pyrophosphate，DMAPP)是通过位于胞质中甲羟戊酸(mevalonic acid，MVA)和质体中甲基赤藓糖磷酸(methylerythritol phosphate，MEP)这2条独立途径合成，这2条途径的初始底物不同，但最终产物都是互为同分异构体的IPP与DMAPP[17-18](图1)。一定数量的IPP和DMAPP在不同异戊烯基转移酶(isoprene synthases，IPSs)的催化下形成不同碳链长度的香叶基二磷酸(geranyl pyrophate，GPP，C10)、法尼基二磷酸(farnesyl pyrophosphate，FPP，C15)以及香叶基香叶基二磷酸 (geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP，C20)等萜类物质合成前体[19-20]。单萜合成酶(monoterpene synthases，MTPSs)、倍半萜合成酶(sesquiterpene synthases，STPSs)和二萜合成酶(diterpene synthases，DTPSs)等萜类合成酶分别以GPP、FPP、GGPP等异戊烯聚合物为底物进行环化、重排和消除等反应形成多样化的萜类分子骨架，植物中大多数二萜与某些单萜、倍半萜类分子骨架需要经过细胞色素P450酶(cytochrome P450 enzymes)的修饰最终成为具有生物功能的成熟萜类化合物，例如松科植物中的二萜化合物主要是以二萜酸的形式存在[7,20-21](图1)。目前，已有数目众多的MEP、MVA途径酶基因和异戊烯基转移酶基因在多种松科植物中被克隆和鉴定。王毅等[22-23]从思茅松(P.kesiyavar．langbianensis)克隆了MEP途径中的第1个酶1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合成酶(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase，DXS)基因和最后1个酶4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶(4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl-diphosphate reductase，HDR)基因。陈晓明等[24]克隆了马尾松GGPPS基因，并将正、反义基因片段转入拟南芥(Arabidopsisthaliana)，发现转正义PmGGPPS的拟南芥较野生型植株叶片中2种二萜组分含量有显著提高，而转反义PmGGPPS的拟南芥植株较野生型则有多种二萜组分含量显著降低，证实了PmGGPPS在二萜生物合成中的重要调节作用。Chen等[25]研究马尾松GGPPS基因表达水平与树脂产量之间的关系发现两者呈显著的线性分布，即马尾松GGPPS基因表达水平与产脂力呈正相关。Qi等[26]克隆了马尾松FPPS基因并表达纯化其蛋白，发现PmFPPS酶能在体外将底物DMAPP和IPP催化形成FPP，此外将PmFPPS基因正反义片段转入烟草(Nicotianatabacum)，结果表明转入正、反义PmFPPS烟草的角鲨烯含量分别显著增加或降低，证实了PmFPPS在三萜生物合成中的调节作用。

TPS-c亚家族主要包括种子植物中参与初级代谢赤霉素合成相关的Class Ⅱ型二萜合成酶基因CPS，小立碗藓中唯一的双功能Class Ⅰ/Ⅱ型二萜合成酶基因CPS/KS也属于该亚家族[16,38]。有一些被子植物的次级代谢相关的Class Ⅱ型二萜合酶基因如水稻中OsCPS1和OsCPS2属于TPS-c亚家族[63]。松科植物中有油松(P.tabuliformis)PtCPS、白云杉PgCPS，北美云杉(P.pungens)PsCPS等二萜合成酶基因属于TPS-c亚家族[41,64]。TPS-e/f亚家族主要包括种子植物中参与初级代谢赤霉素合成相关的Class Ⅰ型二萜合成酶基因KS，还包括一些次级代谢相关的萜类合成酶。松科植物中白云杉PgKS和北美云杉PsKS等基因属于TPS-e/f亚家族[41,64]。

2014年，在全国留学工作会议上习近平重点指出：“留学工作要适应国家发展大势与党和国家工作大局……培养造就更多优秀人才，努力开创留学工作新局面。”习近平这番话也为接下来的“一带一路”背景下高校来华留学生教育工作指明了方向。目前在“一带一路”背景下，我国高校为加强来华留学生教育采取很多有效教育措施，具体措施主要如下。

4 松科植物萜类合成酶的功能

我国具有极为丰富的松科植物资源，如马尾松和油松等特有种，尤其是马尾松，其分布面积与蓄积量均居我国针叶树种前列，作为我国松脂主要来源树种，其产脂量占我国松脂产量的70%以上，具有巨大的经济价值潜力[93]。同时我国大面积松林受到松材线虫病的严重威胁，有研究表明多种萜类与松材线虫病抗性相关[94-96]，因此松科树种萜类合成酶及其基因的研究，对我国松树高产脂与松材线虫抗性的遗传改良和良种选育具有指导意义。目前松科植物萜类合成酶及其基因研究已取得一定进展，但还有几方面问题有待在研究过程中解决。

TPS-d亚家族几乎包含已知所有的裸子植物次生代谢相关的萜类合成酶基因，与TPS-c和TPS-e/f亚家族中初级代谢中赤霉素合成相关的萜类合成酶基因具有明显的差异，这表明裸子植物次生代谢相关的萜类合成酶基因可能具有相对独立的进化过程[16,41]。TPS-d亚家族可进一步分为3组：TPS-d1、TPS-d2和TPS-d3，TPS-d1组主要包含裸子植物单萜合成酶和少数倍半萜合成酶基因，TPS-d2组主要包括大多数裸子植物倍半萜合成酶基因，TPS-d3组主要包含裸子植物二萜合成酶和少数倍半萜合成酶基因，其中几乎所有的针叶树次生代谢合成相关的二萜合酶基因都是双功能Class Ⅰ/Ⅱ型酶基因[16,41]。TPS-d亚家族3个组中都含有倍半萜合成酶基因，但TPS-d3组中已发现的倍半萜合成酶较TPS-d1、TPS-d2组中倍半萜合成酶长约200个氨基酸残基[16]。Martin等[65]和Keeling等[59]对云杉属(Picea)、冷杉属(Abies)与松属(Pinus)等松科植物次生代谢相关的萜类合成酶基因进行系统发育研究发现其都属于TPS-d亚家族。火炬松基因组中鉴定的68个萜类合成酶基因也都属于TPS-d亚家族，TPS-d1、TPS-d2和、TPS-d3组分别含有26、19和23个萜类合成酶基因[58]。

Martin等[65]鉴定了9个挪威云杉的萜类合成酶功能特征，包括4个单萜合成酶、3个倍半萜合成酶以及2个二萜合成酶，其中PaTPS-Myr酶、PaTPS-Far酶、PaTPS-Bis酶和PaTPS-Iso酶具有单产物属性，其余5个萜类合成酶都至少具有3种产物。Hall等[69]针对不同程度白松木蠹象(Pissodesstrobi)抗性的北美云杉，鉴定出了4个蒈烯合成酶和2个桧烯合成酶功能，其主产物分别是蒈烯和桧烯，并且这6个单萜合成酶的主要副产物都是异松油烯；研究发现(+)-3-蒈烯在北美云杉抵抗白松木蠹象侵害过程中可能起到作用，抗性型北美云杉中(+)-3-蒈烯的含量显著高于易感型植株，PsTPS-3car1基因在抗性和易感型北美云杉转录本中均被检测到，而PsTPS-3car2和PsTPS-3car3分别只在抗性和易感植株中被检测到，进一步发现易感植株的基因组中也不存在PsTPS-3car2基因，这可能是引起不同抗性北美云杉中(+)-3-蒈烯含量差异的部分原因。Keeling等[41,59]结合转录组测序，分析了3种云杉植物中涉及4个初级代谢和21个次级代谢的萜类合成酶基因，并鉴定了重组酶蛋白功能，包括15个单萜合成酶、4个半萜合成酶以及6个二萜合成酶，其中PgTPS-Lin酶、PgTPS-Lin-1酶、PgTPS-Lin-2酶与Pg×eTPS-Far/Oci 酶具有单一的重组蛋白催化产物；在白云杉、北美云杉和杂交云杉(P.glauca×P.engelmannii)转录组中，分别鉴定出69、55和20个萜类合成酶序列，这与已获得基因组序列信息的物种中鉴定出的萜类合成酶家族大小相当，并发现萜类合成酶功能差异可以由微小的氨基酸序列差异引起。Huber等[70]从花旗松(P.menziesii)中鉴定了2个单萜合成酶((-)蒎烯/(-)莰烯合成酶、异松油烯合成酶)和两个倍半萜合成酶((E)-β-法尼烯合成酶、(E)-γ-没药烯合成酶)的功能，发现2个单萜合成酶都是至少具有5个产物的多产物酶，而2个倍半萜合成酶都是单产物酶。Hall等[71]同样结合转录组测序在北美短叶松(P.banksiana)和扭叶松(P.contorta)中分别发现了45和33个特有的萜类合成酶基因序列，这与云杉属植物转录组鉴定到的萜类合成酶家族的大小是相似的；北美短叶松和扭叶松中分别表达了9个和8个不同的单萜合成酶重组蛋白，通过酶活性功能鉴定发现这17个单萜合成酶只能使用GPP作为底物催化形成不同的单萜产物，而对FPP和GGPP没有发现酶催化活性。Phillips等[72]鉴定了火炬松中(+)-α-蒎烯合成酶、(-)-α-蒎烯合成酶以及α-松油醇合成酶功能，发现K+和Mn2+是获得最佳酶活性所必须的，以Mg2+代替Mn2+时反应速率降低。此外，对两种产物旋光性不同的α-蒎烯合成酶一级结构分析发现其相似度仅有72%，而与其他裸子植物中具有相同旋光性产物的单萜合成酶的氨基酸序列相似度反而更高。最近，Trindade等[73]从海岸松(P.pinaster)和意大利石松(P.pinea)鉴定了α-蒎烯合成酶功能特征，发现其主产物为α-蒎烯，副产物为β-蒎烯，并发现低温和Mn2+可以明显促进产物的积累。雷蕾等[74-75]从湿地松中克隆了2个α-蒎烯合成酶和1个β-蒎烯合成酶基因，发现其编码氨基酸序列与其他松科植物同源基因相似度在75%以上，并发现(-)-α-蒎烯合成酶基因与实测年总产脂力、基础产脂力和潜在产脂力具有显著相关，可以作为产脂性状关联的候选基因。魏永成[76]对不同松材线虫抗性的马尾松进行了转录组测序，发现MVA、MEP途径中HMGR、DXS以及多个萜类合成酶如，(-)-α-蒎烯合成酶、(-)-β-蒎烯合成酶、(+)-α-蒎烯合成酶、(-)-柠檬烯合成酶、长叶烯合成酶在高抗和易感型马尾松接种线虫后表达量具有极显著差异，说明这些萜类合成酶可能在马尾松系统性防御反应中发挥一定作用。陈晓明[77