重组人生长激素对兔角膜损伤早期修复的研究

张 弛，赵刚平，王 萍，程冬梅，谢 莉

0引言

角膜上皮损伤是世界范围内最常见的角膜疾病之一，角膜炎症、手术、外伤、肿瘤等均可造成角膜上皮损伤。角膜上皮损伤修复是一个复杂的过程，与角膜上皮细胞增殖移行、角膜神经再生及炎症反应都有关系[1]。局部药物使用是目前公认的治疗角膜上皮损伤最直接有效的手段，但目前临床使用的药物效果不尽如人意。重组人生长激素(recombinant human growth hormone，rHGH)是一种人工合成的具有人生长激素功能的蛋白类药物，可有效促进人体其他组织器官的上皮细胞及外周神经纤维的恢复[2]。关于角膜上皮损伤修复的研究发现，rHGH对体外人角膜上皮细胞移行有积极作用，但其对活体角膜上皮损伤的修复有无效果尚不清楚。本研究拟采用rHGH作用于角膜上皮损伤兔模型，通过动物实验探讨rHGH对角膜上皮损伤早期修复的作用。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1实验动物标准实验用清洁级健康雄性成年新西兰大白兔32只，体质量约3kg，均由广东省动物实验中心提供，按标准动物饲养条件饲养。本研究通过动物伦理委员会审查。

1.1.2主要试剂和仪器重组人生长激素(美国洛杉矶生物医学研究所)，戊巴比妥钠(上海容创生物技术有限公司)，速眠新(吉林省华牧动物保健品有限公司)，盐酸奥布卡因(日本参天制药株式会社)，兔炎症因子检测试剂盒(美国Ray Biotech)。手术显微镜(OPMI VARIO 700，德国蔡司)，角膜环钻(直径8mm，苏州六六视觉医疗器械有限公司)。

1.2方法

1.2.1兔角膜上皮损伤模型的建立32只兔适应性喂养1wk后，3%戊巴比妥钠(1mL/kg)+速眠新(0.3mL/kg)肌肉注射全身麻醉，滴用0.4%盐酸奥布卡因局部表面麻醉1次，将兔用手术孔巾包裹置于手术台上，用角膜环钻制成双眼角膜中央直径8mm的角膜上皮损伤模型。术后经荧光素钠染色，裂隙灯下观察，缺损呈圆形，仅去掉上皮，基质层完好未损伤，均符合后续实验标准。

1.2.2实验分组及干预造模成功后，每只兔子随机选取1眼为rHGH组，另1眼即为对照组。rHGH组滴浓度为20nmol/L的rHGH(生理盐水做溶剂)，对照组滴生理盐水，每2h滴眼1次，每次20μL；夜间22∶00～次日晨8∶00涂妥布霉素眼膏。

1.2.3角膜上皮损伤愈合能力检测分别在造模后24、48、72h行双眼荧光素钠染色，并在裂隙灯下拍照记录角膜愈合情况。用Mage J软件测量染色面积，并计算角膜上皮愈合率，角膜上皮愈合率=(0h染色面积-观察时染色面积)/0h染色面积×100%。

1.2.4角膜上皮神经再生能力检测分别在造模后24、48、72h用角膜敏感度测量计(Cochet-Bonnet)检测中央角膜敏感度，评估角膜上皮神经再生能力。

1.2.5泪液炎症因子水平检测分别在造模后24、48、72h收集泪液，用兔炎症因子检测试剂盒检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1α、IL-17α、IL-21、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和Leptin在泪液中的表达情况。

统计学分析：采用SPSS 17.0统计学软件分析数据。计量资料采用均数±标准差表示，组间多个时间点比较采用重复测量数据的方差分析；若存在组间差异性，则采用配对样本t检验比较两组之间的差异；若存在时间差异性，则采用LSD-t检验比较组内不同时间点的差异。P<0.05时认为差异具有统计学意义。

2结果

2.1 rHGH对兔角膜上皮损伤愈合的影响造模前后，两组角膜上皮愈合率比较，差异有统计学意义(F时间=1862.747，F组间=37.186，F时间×组间=13.005，均P<0.01)。rHGH组角膜上皮愈合速度比对照组快，造模后48、72h，两组角膜上皮愈合率比较差异有统计学意义(均P<0.05)，见表1，图1。

图1 rHGH对兔角膜上皮损伤的愈合影响 A：角膜上皮损伤24、48、72h后，对照组与rHGH组兔角膜荧光素钠染色面积；B：兔角膜上皮损伤24、48、72h后角膜上皮愈合率。bP<0.01 vs 同组造模前；cP<0.05 vs 对照组。

表1 两组角膜上皮愈合率比较

2.2 rHGH对兔角膜上皮神经再生的影响造模前后，两组中央角膜敏感度比较，差异有统计学意义(F时间=301.187，P时间<0.01；F组间=4.175，P组间=0.045；F时间×组间=5.669，P时间×组间<0.01)。rHGH组角膜上皮神经再生能力比对照组强，造模后48h，两组中央角膜敏感度比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2，图2。

表2 两组中央角膜敏感度比较

图2 rHGH对兔中央角膜敏感度的影响 aP<0.05 vs 同组造模前；cP<0.05 vs 对照组。

2.3 rHGH对兔泪液炎症因子水平的影响造模后各时间点两组泪液TNF-α和IL-1α表达均较造模前增加，且造模后24、48h对照组表达均高于rHGH组(P<0.05)。造模后24、48h，两组泪液MMP-9表达均较造模前增加，且造模后48h对照组表达高于rHGH组(均P<0.05)。造模后24、48h两组泪液IL-21表达均较造模前增加(P<0.05)。造模后各时间点两组泪液IL-17α、Leptin表达与造模前相比及两组之间比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表3、4，图3。

表3 两组泪液炎症因子水平比较

图3 rHGH对兔泪液炎症反应的影响 A：TNF-α；B：Leptin； C：MMP-9；D：IL-1α；E：IL-17α；F：IL-21。aP<0.05，bP<0.01 vs 同组术前；cP<0.05，dP<0.01 vs 对照组。

表4 两组泪液炎症因子水平比较重复测量数据方差分析结果

3讨论

rHGH是一种人工合成的具有人生长激素，最先是用于治疗成年人和儿童生长激素(growth hormone，GH)缺乏类疾病[3]。随后科学家们在动物和细胞实验中均发现rHGH能激活表皮和上皮细胞移行，促进成纤维细胞增殖[4-5]。随着研究的深入，学者们发现人生长激素(human growth hormone,HGH)对角膜也有调控作用，但相关报道有限。Ciresi等[6]报道指端肥大症患者的角膜厚度较正常人群厚，同时也观察到GH缺乏的患者经过1a GH治疗后，角膜厚度厚于治疗前和对照组。Ding等[7]发现rHGH可以促进角膜上皮细胞和角膜成纤维细胞体外移行，而移行能力依靠完整角膜上皮细胞与成纤维细胞之间的交互作用。以往研究通常是在大鼠或小鼠模型上进行，其与人眼差距较大。但兔眼的解剖结构、生理病理与人眼较为接近，同时便于损伤模型的建立，是比大鼠或小鼠更为理想的实验动物。同时因为雌性动物体内激素状态较为复杂，为了尽量去除对本研究有干扰的因素，我们所选用的实验动物均为雄性新西兰兔，实验结果也表明rHGH对兔角膜上皮损伤修复较对照组有明显加快促进作用。

rHGH除了能促进上皮细胞移行外，对神经修复也起着重要作用。Gabrielpillai等[8]报道rHGH有助于内耳神经退行性变的好转，Wasinski等[9]发现大脑中的生长激素信号调节许多生理功能，如认知、行为、神经内分泌变化和新陈代谢，有助于神经元的修复和重建。虽然对rHGH在全身创口恢复中作用的研究已有较多，但对其在角膜损伤恢复中所扮演的角色却未见报道。本研究通过测量角膜上皮损伤后中央角膜敏感度发现rHGH有助于角膜神经修复。

我们在前期研究中也发现角膜屈光手术后，炎症反应会不同程度地影响角膜损伤修复，多种炎症因子和角膜上皮愈合、角膜神经修复程度有关[10]。TNF-α是由激活的巨噬细胞、单核细胞和淋巴细胞等分泌的一类促炎性介质，在健康角膜上皮中可检测到TNF-α表达，也发现从伤口培养的成纤维细胞能够分泌TNF-α。TNF-α被证实可以刺激纤维连接蛋白诱导角膜上皮细胞移行和角膜基质细胞增殖，同时可以诱导炎症反应产生，调节上皮细胞层和角膜基质层的损伤修复[11-12]。IL-1α可在角膜上皮中表达，当角膜上皮受损后，IL-1α接触角膜基质细胞后可以通过自分泌循环促使角膜基质细胞分泌IL-1α，对角膜基质细胞和成纤维细胞起到消极凋亡的作用。这种负性趋化作用可能对保持角膜组织重塑起作用[13]。在角结膜干燥症患者泪液中，IL-1α的浓度升高，这可能与角膜上皮细胞损伤或死亡后，使得IL-1α释放有关。但是IL-1α在没有角膜上皮损伤的情况下是不能移行至角膜基质层的，除非角膜上皮损伤，角膜上皮屏障功能破坏[14]。MMP-9是明胶酶类的一种，可以降解多种胶原和蛋白，上皮下MMP-9的表达和基底膜降解有关，MMP-9可以和一些炎症因子(如TGF-β、IL-1)相互调控，能作为潜在的角膜基质修复炎症介质[15]。在角膜损伤后，炎症反应会上调和激活MMP-9的表达，使之参与角膜修复过程，使得这些炎症因子被释放、激活，这些炎症因子同时又能造成淋巴细胞浸润，T细胞活化，再通过穿孔素、端粒酶、Fas配基的作用或细胞毒性作用，破坏溶解角结膜上皮细胞或促使细胞凋亡，从而损害眼表结构，引起泪膜不稳定，延缓角膜损伤愈合[16-17]。本研究发现，rHGH组在角膜损伤后泪液中IL-1α、TNF-α和MMP-9的表达均较对照组低，明显降低角膜损伤后的炎症反应，有助于角膜上皮的愈合，但具体机制目前仍不清楚。有研究报道胰岛素样生长因子-1(IGF-1)可能是一个重要的潜在介质。部分研究发现局部使用IGF-1有助于角膜上皮损伤修复，这可能与IGF-1促进角膜上皮细胞移行和角膜神经再生有关[18-19]，其具体联系有待进一步研究。

综上所述，rHGH可以减轻角膜上皮损伤后炎症反应，加速兔角膜上皮损伤愈合和神经修复。