电子束辐照对猕猴桃品质及抗性系统的影响

黄天姿，梁 锦，王 丹，张 璐，李瑞娟，杨淑霞，罗安伟*

（西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100）

猕猴桃（Actinidia chinensis）以其良好的口感、丰富的营养价值以及保健功能而深受消费者青睐，素有水果之王的称号。然而，猕猴桃是典型的呼吸跃变型水果，且皮薄汁多，易受机械损伤和微生物侵染而腐烂[1]。猕猴桃采后贮运期间发生的病害有软腐病、灰霉病、青霉病等。灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）的科学研究重要性在十大植物病原真菌中排名第二[2]，由其引起的灰霉病是猕猴桃采后的主要病害之一[3]。

电子束辐照作为一种新型绿色的物理冷加工技术，其电离辐射在食品中所产生的辐射化学和辐射生物学效应具有抑制生理代谢、延缓后熟衰老、抑制发芽、杀虫灭菌和改进品质等效果[4]。电子束辐照可以显著降低红辣椒粉中的总需氧微生物数[5]，完全消除真空包装烟熏鸭肉的总需氧细菌和大肠杆菌[6]，显著降低柑橘中的酵母和霉菌数以及总需氧微生物数[7]。张婷[8]用2.0 kGy以上电子束辐照灰葡萄孢菌分生孢子，发现电子束辐照可以显著抑制灰葡萄孢菌分生孢子的萌发及芽管伸长，延迟其萌发时间，导致芽管畸形，降低其致病力。

目前，国内外电子束辐照在果蔬保鲜方面的研究主要集中在保鲜机理及其对活性成分的影响上。在 蓝莓[4]、柑橘[7]、草莓[8]、苹果[9]、樱桃[10]等果蔬上有一定研究，如代守鑫[10]研究表明，电子束辐照能减少甜樱桃的烂果率，抑制细菌生长，保持花青素、总酚、可溶性固形物以及总糖含量。而电子束在猕猴桃保鲜方面的研究较少，周慧娟等[11]研究证明电子束辐照有效地控制了红阳猕猴桃采后的软化衰老进程，能减少其贮藏期间的腐烂变质，保持果实的外观色彩和果肉色泽。电子束处理对猕猴桃灰霉病相关的胞外抗性酶活性及抗病系统的影响还鲜见报道。本实验以接种B. cinerea模拟‘海沃德’猕猴桃被该病菌侵染，再以不同剂量电子束辐照处理，分析比较猕猴桃在冷藏过程中的品质变化，以及辐照对抗性相关酶过氧化物酶（peroxidase，POD）、苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）和β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，GLU）活力及抗病物质多酚、类黄酮和膜脂过氧化产物丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的影响，评价高能电子束辐照对猕猴桃贮藏品质影响及对灰霉病的抑制效果，为电子束辐照技术在猕猴桃防腐保鲜上的应用提供理论与技术依据。

1 材料与方法

1.1 菌种、材料与试剂

灰葡萄孢菌菌种由西北农林科技大学食品科学与工程 学院果蔬贮藏与加工实验室从冷库中腐烂的猕猴桃上分离得到，并经分子生物学鉴定。

猕猴桃为‘海沃德’品种，产地为陕西省周至县猕猴桃基地，于2018年10月采收成熟度一致（可溶性固形物（total soluble solids，TSS）质量分数6.0%～6.5%）、大小均一、无病虫害、无机械伤的果实，采收后立即运回实验室，散去田间热后，备用。

没食子酸、H2O2、NaOH 天津市天力化学试剂有限公司；芦丁 广东光华科技股份有限公司；昆布多糖 北京博奥拓达科技有限公司；福林-酚试剂 美国 Sigma公司；聚乙烯基聚吡咯烷酮（polyethylene polypyrrolidone，PVPP） 北京索莱宝科技有限公司；3,5-二硝基水杨酸 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

ESS-010-03电子直线加速器 陕西省方圆辐照有限公司；N6000双光束紫外分光光度计 上海佑科仪器仪表有限公司；TA.XT PLUS物性测定仪 英国Stable Micro Systems公司；HC-3018R高速冷冻离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；T-203电子天平 北京科普尔科技发展有限公司；DK-98-11-A电热恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司；PAL-1数显糖度计 日本爱拓有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌悬液制备与接种

B. cinerea菌悬液制备：使用前将B. cinerea菌种接种于PDA平板培养基上进行活化，用无菌水配制成悬浮液备用，菌液浓度为1×106CFU/mL。

接种：将猕猴桃果实用体积分数2%的次氯酸钠溶液浸泡2 min，无菌水冲洗2～3 次，自然晾干。试样分为4 组，每组200 个，均在果实赤道部位均匀取4 个点，用直径1 mm的消毒牙签扎深度为4 mm的小孔，用注射器分别在小孔中注入1×106CFU/mL孢子悬浮液15 μL[12]。

1.3.2 电子束辐照处理猕猴桃

电子束辐照处理：辐照装置为ESS-010-03电子直线加速器（额定能量为10 MeV、功率10 kW、扫宽800 cm、束流2 mA）。将4 组果实装入0.03 mm厚的聚乙烯袋中，单层摆放于辐照托盘中，置于传送带上送入辐照室进行辐照处理，辐照剂量分别为0（对照）、0.4、0.8、1.2 kGy；将不同剂量辐照处理的猕猴桃贮藏于0～1 ℃、相对湿度（relative humidity，RH）90%～95%的冷库中备用。贮藏期间，每15 d随机取样，测定各项指标，每个处理重复3 次。以果肉硬度低于0.5 kg/cm2时结束实验，此时果实已软化至可食用或腐烂，以此为标准，对照组贮藏期为90 d，各辐照处理组贮藏期为75 d。

1.3.3 指标测定

1.3.3.1 质量损失率测定

称量猕猴桃果实初始及贮藏后质量，质量损失率按下式进行计算。

1.3.3.2 果肉硬度测定

物性测定仪穿刺法测定果肉硬度，在TPA模式下，随机取5 个果实进行测定，在猕猴桃果实赤道部位均匀取3 点，削去果实表皮，重复3 次。探头为P2（直径为0.5 cm），测试模式为Messure Force in Compression，参数设置为：预压速率1.00 mm/s、下压速率5.00 mm/s、压后上行速率5.00 mm/s、两次压缩中间停顿5.00 s，硬度单位为kg/cm2。

1.3.3.3 TSS、可滴定酸质量分数测定

随机取4 个猕猴桃果实，去皮后切除果心处的果肉，用榨汁机研磨榨汁。用蒸馏水将数显糖度计调零后测定TSS质量分数，单位为%。

可滴定酸（titrable acidity，TA）质量分数测定参照曹建康等[13]的酸碱中和法，TA以柠檬酸计，重复3 次。

1.3.3.4 多酚、类黄酮含量测定

多酚、类黄酮含量的测定参照谢敏[14]的方法并略有改动。称取2 g果肉，加少许预冷过的体积分数1%盐酸-甲 醇溶液，冰浴充分研磨，转移到20 mL容量瓶中，用体积分数1%盐酸-甲醇溶液定容，在冰箱中放置20 min，7500 r/min离心20 min，取上清液分别在765、510 nm波长处测定吸光度，分别用于多酚、类黄酮含量的计算。

1.3.3.5 POD、PAL、GLU活力及MDA含量测定

POD、PAL、GLU活力及MDA含量测定参考曹建康等[13]的方法。取3 g冷冻（-80 ℃）果肉，分别加入3 mL对应提取缓冲液，冰浴研磨成匀浆，10000 r/min冷冻离心30 min，提取出粗酶液用于POD、PAL、GLU活力的测定。以每分钟每克鲜组织酶促反应体系在470 nm波长处吸光度增加1为1 个POD活力单位（U）；以每小时每克鲜组织酶促反应体系在290 nm波长处吸光度增加0.01为1 个PAL活力单位（U）；以每克鲜质量组织每秒形成1 μmol葡萄糖为1 个GLU活力单位（U）。

取1 g冷冻果肉，加入5 mL 100 g/L三氯乙酸溶液，冰浴研磨至匀浆，10000 r/min冷冻离心20 min，上清液用于MDA含量的测定。单位为mmol/g，结果以鲜质量计。

1.4 数据处理与分析

所有指标测定平行3 次，结果表示为平均值±标准差，采用SPSS 18.0软件进行方差分析，用Duncan法进行多重比较，P＜0.05表示存在显著性差异。采用Origin 8.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 电子束辐照对侵染B. cinerea的猕猴桃质量损失率、硬度的影响

图 1 电子束辐照对侵染灰葡萄孢菌‘海沃德’猕猴桃质量损失率（A）、硬度（B）的影响Fig. 1 Effect of electron beam irradiation on mass loss rate (A) and hardness (B) of ‘Hayward’ kiwifruit infected with gray mold

质量损失率是评价水果采后品质变化的重要指标。质量损失是水果活跃的新陈代谢作用加速果实呼吸消耗和蒸腾失水所致[15]。如图1A所示，随着贮藏时间延长，果实质量损失率增加，电子束辐照处理能明显降低猕猴桃贮藏过程中的质量损失率，贮藏75 d时0.8 kGy辐照组的质量损失率比对照组低20%，但不同辐照组之间的质量损失率整体上差异不显著（P＞0.05），说明电子束辐照可以减少猕猴桃的呼吸消耗和水分流失，即抑制呼吸代谢和蒸腾作用从而达到保鲜的效果，但与辐照剂量无关。Gomes等[16]用不同剂量（0、1、2、3 kGy）电子束辐照西蓝花，再将西蓝花于4 ℃、RH 95%条件下贮藏14 d，其质量损失率随贮藏时间延长显著 增加（P＜0.05），但剂量对质量损失率的影响不显著（P＞0.05），与本实验结果一致。

猕猴桃果实后熟软化是贮藏期品质变化的显著表现。如图1B所示，果肉硬度随贮藏时间延长呈下降趋势，0～15 d硬度迅速下降，之后缓慢下降。贮藏期内，对照组果实的硬度整体上最高，15 d时对照组硬度为6.42 kg/cm2，显著高于各辐照处理组（P＜0.05）， 说明接种B. cinerea后进行电子束辐照处理会对猕猴桃 果肉硬度产生一定的负面影响，加快软化进程。除60 d时1.2 kGy辐照组硬度显著大于0.4、0.8 kGy辐照组外，其他时间辐照组之间不存在显著性差异（P＞0.05）。

Kheshti等[9]用377 Gy和1148 Gy电子束辐照‘富士’苹果后将其先冷藏7 d再于室温下贮藏7 d，结果发现与对照组相比，两个剂量处理均使果肉硬度下降，且1148 Gy辐照组果肉硬度显著低于对照组，说明不适宜剂量的电子束辐照会对硬度产生不良影响。B. cinerea能产生果胶酶、纤维素酶等多种细胞壁降解酶，导致硬度降低，且这些酶与该菌的致病作用有一定的相关性，在侵入和定植寄主组织中发挥着重要的作用。陈召亮等[17]的研究结果表明，2.0 kGy以上电子束辐照可以显著抑制B. cinerea聚甲基半乳糖醛酸酶、β-葡萄糖苷酶等酶的活性，降低该菌菌丝对草莓细胞壁的穿透能力，导致侵染致病活性下降，有效减轻采后草莓灰霉病的发生，维持果实硬度。由于本研究中采用的辐照剂量均低于2.0 kGy，可能导致接种B. cinerea后，在灰霉菌和辐照处理的共同影响下，辐照组果肉硬度低于对照组。

2.2 电子束辐照对侵染B. cinerea的猕猴桃TSS、TA 质量分数的影响

图 2 电子束辐照对侵染灰葡萄孢菌的‘海沃德’猕猴桃TSS（A）、TA（B）质量分数的影响Fig. 2 Effect of electron beam irradiation on total soluble solids (A) and titratable acid (B) contents in ‘Hayward’ kiwifruit infected with gray mold

如图2A所示，果实TSS质量分数在整个贮藏期呈上升趋势。在15～60 d，对照组TSS质量分数高于辐照组，其中30～45 d对照组TSS质量分数显著高于辐照组 （P＜0.05），75 d时对照组TSS质量分数最低，其中0.4 kGy辐照组的TSS质量分数显著高于其他3 组 （P＜0.05）。因此，适宜剂量的辐照处理能抑制TSS质量分数在贮藏前期的上升与贮藏后期的下降，延缓后熟衰老进程，保持果实的品质。周慧娟等[11]用高能电子束辐照‘红阳’猕猴桃，整个贮藏期内500 Gy处理组TSS质量分数显著高于对照组。白婷等[18]用0.2 kGy电子束辐照龙眼，在30 ℃下贮藏6 d，辐照组TSS质量分数显著高于对照组，说明辐照处理能有效延缓龙眼果实贮藏过程中营养物质的损失，保持果实的品质。

TA是呼吸作用的底物之一，是果蔬采后生命活动的物质基础，采后冷藏期间，TA作为呼吸底物被消耗[11]。 图2B显示，贮藏期内，各组果实TA质量分数呈下降趋势。除60 d外，3 个辐照处理组中至少有一组的TA质量分数高于对照组，表明辐照处理可以抑制猕猴桃的呼吸等生理代谢，从而抑制TA质量分数的下降。60 d时对照组TA质量分数显著高于辐照组（P＜0.05）。60、75 d辐照组中1.2 kGy处理组TA质量分数最低，说明高剂量处理组猕猴桃TA消耗更快。除15、75 d外，0.4、0.8 kGy处理组TA质量分数差异不显著，故整体来看，贮藏期内适宜辐照剂量（0.4 kGy和0.8 kGy）对TA质量分数影响无显著差异，这与Nam等[7]研究发现0.4 kGy和1.0 kGy电子束辐照柑橘TA质量分数不受辐照剂量影响以及Ramakrishnan等[19]发现0.4 kGy和1.0 kGy的电子束辐照不会改变葡萄柚的TA质量分数结果类似。

2.3 电子束辐照对侵染B. cinerea的猕猴桃多酚、类黄酮含量的影响

图 3 电子束辐照对侵染灰葡萄孢菌的‘海沃德’猕猴桃多酚（A）、类黄酮（B）含量的影响Fig. 3 Effect of electron beam treatment on the contents of polyphenols (A) and flavonoids (B) in ‘Hayward’ kiwifruit infected with gray mold

多酚是重要的植物次生代谢产物，其本身及其氧化产物均具有抗菌功能，可提高植物抗病性[20]。其含量是评价果实对病害抗性的指标之一。如图3A所示，贮藏期内，各辐照组的多酚含量呈下降趋势，对照组呈先下降再上升后下降趋势，75 d时出现最高峰。 15 d时0.4 kGy辐照组多酚含量比对照组高15.09% （P＜0.05），其他组与对照组无显著差异，可能是低剂量电子束处理对多酚的诱导效应强于高剂量；30～75 d时对照组多酚含量高于辐照组，且在60、75 d时具有显著差异（P＜0.05）。贮藏期内B. cinerea的生长繁殖会诱导体内多酚生成，这是果实受到病菌侵害时的自我免疫机制之一；而辐照处理一定程度会抑制B. cinerea的生长，从而使诱导的多酚含量减少，故辐照组多酚含量低于对照组，且0.4 kGy辐照处理对维持多酚含量效果较好。Tejedor-Calvo等[21]用电子束辐照黑松露，辐照组多酚含量低于对照组，且低剂量组的多酚含量高于高剂量组；de Jesús Ornelas-Paz等[22]用γ射线（150、400 Gy和1000 Gy）辐照柑桔，多酚含量增加且1000 Gy辐照组多酚含量最高，但某些单体酚含量下降；辐照对多酚含量的影响存在差异，这与植物种类、多酚组成等诸多因素有关[23]。

类黄酮含量也是评价果实对病害抗性强弱的指标之一。如图3B所示，贮藏期内，类黄酮含量总体呈先上升后下降的趋势，且辐照处理使类黄酮含量最高峰提前出现15～30 d；前45 d对照组类黄酮含量显著低于0.4 kGy辐照组的类黄酮含量，且0.4 kGy辐照组在45 d时出现最高峰，含量峰值大于其他3 组最高峰峰值，与对照组相比，含量最高峰峰值升高25.52%。综上可知，适宜剂量的电子束辐照可以显著提高侵染B. cinerea的‘海沃德’在贮藏期的类黄酮含量，从而提高果实抗病性。这与 Reyes等[24]用1.0～3.1 kGy电子束辐照芒果，发现抗性物质黄酮含量升高的研究结果相似。

2.4 电子束辐照对侵染B. cinerea的猕猴桃POD、PAL 活力的影响

猕猴桃的生理组织结构和生化抗性可在一定程度上抵抗病原菌的侵染。生化抗性主要是由真菌感染引起的植物代谢变化，引起植物抗毒素、酚类化合物含量和抗性酶活力的变化[25]。B. cinerea作为一种生物因子、高能电子束作为一种物理因子，均可使猕猴桃产生一定的诱导抗性，激活果实自身的抗病防御系统从而有效抵御或杀死病原菌[8]，而果实往往通过增强抗性相关酶活力来增强自身抗病性，因此猕猴桃POD、PAL和GLU等防御酶活力一定程度上可以反映猕猴桃果实的抗病性。

POD通过将H2O2转化为H2O和O2以清除细胞内活性氧、将酚类物质氧化成醌以及参与木质素的合成达到抑制病原菌和延缓果实衰老的作用[26]。可通过POD活力衡量系统清除自由基的能力。从图4A可知，辐照处理组的POD活力整体上呈先上升后下降的趋势，对照组呈 上升-下降、再上升-下降的趋势。在0～30 d，辐照处理组POD活力整体上显著高于对照组（P＜0.05），且活力最高峰提前15～30 d出现。0.4 kGy辐照组贮藏15 d达到POD活力峰值，比另两个剂量辐照组提前15 d，且POD活力峰值高于其他3 组的活力最高峰峰值，其中比对照组活力最高峰峰值增加2.36%，说明适宜剂量的辐照处理可提高侵染B. cinerea猕猴桃的抗衰老能力及抗病性。 Pan Liuyi等[27]用0.1 mmol/L茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）处理接种葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）的猕猴桃，结果表明MeJA处理显著增强了猕猴桃的POD活力；Luo Anwei等[28]在0 ℃下用79.44 mg/kg 气态臭氧分别处理接种扩展青霉和灰葡萄孢霉浸染的猕猴桃，发现果实的POD活力显著提高；郭叶[29]用1-甲基环丙烯对猕猴桃进行保鲜，发现保鲜组POD活力显著高于对照组，且出峰时间晚于对照组。综上所述，不同的激发子可以有效诱导POD等植物防御相关酶的活力升高，从而增强其对真菌的抗感染能力。电子束辐照猕猴桃，可以诱导果实抗性相关酶POD活力增加，同时活力最高峰出现时间提前，果实提前产生抗性。

图 4 电子束辐照对侵染灰葡萄孢菌的‘海沃德’猕猴桃POD（A）、PAL（B）活力的影响Fig. 4 Effect of electron beam treatment on the activity of POD (A) and PAL (B) in ‘Hayward’ kiwifruit infected with gray mold

PAL是催化苯丙烷类代谢途径的关键酶和限速酶[30]， 其活力与抗病性成正相关。如图4B所示，贮藏期内PAL活力基本呈先升高后降低的趋势，且辐照组PAL活力显著高于对照组（P＜0.05），0.4、0.8 kGy和1.2 kGy辐照组活力最高峰峰值较对照组分别高27.92%、44.35%、45.94%，说明电子束辐照可显著增强抗性酶PAL的活力，使猕猴桃诱导抗病性增强。张婷[8]用0～3.0 kGy的电子束辐照接种B. cinerea的草莓，发现1.0 kGy的电子束辐照可以显著提高PAL等抗性相关酶的活力。说明电子束辐照能够显著增强接种B. cinerea果实的PAL活力，诱导果实产生抗病性。

2.5 电子束辐照对侵染B. cinerea的猕猴桃GLU活力、MDA含量的影响

图 5 电子束辐照对侵染灰葡萄孢菌的‘海沃德’猕猴桃GLU活力（A）、MDA含量（B）的影响Fig. 5 Effect of electron beam treatment on GLU activity (A) and MDA content (B) in ‘Hayward’ kiwifruit infected with gray mold

GLU是重要的病程相关蛋白质，可以分解病原菌的细胞壁或菌丝体，对病原菌有直接的杀伤作用[31]，可由病原菌、紫外照射、机械损伤等多种生物和非生物因子诱导产生，以增强抗病力。从图5A可看出，辐照处理提高了果实的GLU活力，且各辐照组GLU活力峰值均明显高于对照组，0.8、1.2 kGy辐照组首次GLU活力峰出现时间提前30 d。0.4、0.8 kGy和1.2 kGy辐照组活力最高峰峰值较对照组分别高5.01%、24.01%、27.51%。Jin Peng等[32]的研究结果表明，热空气处理接种B. cinerea的草莓，GLU活力显著升高，草莓的诱导抗病性增强；Cheng Lilin等[33]以接种灰葡萄孢菌和链格孢菌的猕猴桃为材料进行研究，结果发现单独或联合使用拮抗性酵母与β-氨基丁酸可诱导几丁质酶和GLU活力增强，与本实验的结果一致。

活性氧引起的脂质过氧化是植物组织中膜损伤的主要机制，并且产生多种副产物，MDA就是其中之一[34]，其含量可以衡量果肉细胞受到损伤的程度[35]。图5B显示，贮藏期内辐照处理组MDA含量均高于对照组，表明辐照处理对猕猴桃果肉细胞产生了一定程度的损伤，导致细胞膜受损，引起膜脂过氧化反应。辐照处理组中，0.8 kGy辐照处理组的MDA含量整体上最低，膜脂质过氧化程度较低，对猕猴桃损伤较小。

3 结 论

通过对不同剂量电子束辐照侵染B. cinerea的‘海沃德’猕猴桃贮藏期品质和生理指标的变化研究，发现电子束辐照处理能降低猕猴桃的质量损失率，抑制TA质量分数的下降。同时，与对照组相比，经电子辐照处理后的猕猴桃抗性物质类黄酮含量最高峰峰值升高，抗性相关酶POD、PAL、GLU活力整体上升高，且0.8、1.2 kGy辐照组GLU活力首次出现峰值的时间提前。研究结果表明，电子束辐照可以通过提高抗性相关酶活力，提高类黄酮含量来增强果实自身抗性，减轻采后灰霉病的发生。本研究所选用的3 个剂量中，0.4 kGy处理能较好地保持猕猴桃品质，在30～60 d质量损失率最低、60～75 d TSS质量分数最高，且类黄酮含量和POD活力的最高峰峰值最大，故0.4 kGy电子束辐照可以在保证品质的同时，作为猕猴桃采后灰霉病的新型有效防治手段。

综合来看，电子束辐照对果实病害的防治作用，不仅与辐照破坏菌丝体内蛋白有关，还与辐照诱导果实防御酶活力升高，增强果实本身抗病性有关。本实验为电子束防腐保鲜技术在猕猴桃中的应用提供了理论依据，为探求绿色、高效的防腐保鲜技术提供了参考。