超高效液相色谱-串联质谱法测定薏仁米中 25种磺酰脲类除草剂残留

王显贵，吴小毛，杨晓凤，刘 炜

(1.贵州大学，贵州贵阳 550025；2.兴仁市农业农村局，贵州兴仁 562300； 3.四川省农业科学院 分析测试中心，四川成都 610066)

磺酰脲类除草剂是全球主流除草剂之一，具有品种较多、高活性、低毒、低剂量、广谱、高选择性等特点，属于内吸传导型选择性除草剂，通过对植物体内乙酰乳酸合成酶(ALS)的抑制，抑制植物细胞的分裂，使细胞不能正常生长[1]。

薏苡为禾本科薏苡属草本植物，其干燥成熟的种仁是一种既有丰富营养又有独特药理作用的药食两用资源，具有抗肿瘤、抗炎镇痛、降血糖、降血压和提高机体免疫力等多种药理活性[2-4]。薏苡是多年生草本植物，种植过程中影响其产量、品质的因素很多，病虫草害是影响产量、品质的重要因素之一。目前化学除草、防治病虫害是保障薏仁米高产稳产、品质的重要措施。磺酰脲类除草剂对麦田中许多一年生或多年生阔叶杂草有较好的防效[5]。随着该类除草剂的广泛使用，其在薏仁米中残留，对人类身体健康造成一定影响。

近几年，磺酰脲类除草剂的残留分析方法主要有色谱法[6-8]、色谱-串联质谱法[9-14]、毛细管电泳法[15]。目前关于同时检测薏仁米中多种磺酰脲类除草剂的方法尚未见报道。QuEChERS是一种具有快速(Quick)、简单(Easy)、成本低(Cheap)、高效(Effective)、稳定(Rugged)、安全(Safe)等特点的前处理技术[16]，本研究以QuEChERS前处理技术为基础，采用超高效液相色谱-串联质谱 (UPLC-MS/MS) 法，建立了薏仁米中25种磺酰脲类除草剂的检测方法，旨在为薏仁米中农药残留监测提供高效技术支持。

1 材料与方法

1.1 药剂、试剂与仪器

25种磺酰脲类除草剂标准品(质量分数＞97%，德国Dr. Ehrenstorfer公司)；甲醇、乙腈(质谱纯/色谱纯，美国Fisher公司)；甲酸、甲酸铵(色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司)；氯化钠(分析纯，四川西陇化工有限公司)；无水硫酸镁(质量分数≥98%，德国CNW科技公司)；石墨化炭黑(GCB)、十八烷基键合相硅胶(C18)吸附剂、乙二胺-N-丙基硅烷(primary secondary amine，PSA)吸附剂(上海安谱实验科技股份有限公司)；试验用水均为超纯水。

Waters ICLASSXEVO TQ XS型超高效液相色谱-串联质谱仪配ESI离子源(美国沃特世公司)；高速万能粉碎机(北京市永光明医疗仪器有限公司)；JA3003型分析天平(上海精密科学仪器有限公司)；涡旋振荡器(美国Scientific Industries公司)；Neofuge 18R型高速离心机(香港力康生物医疗科技控股集团)；Milli-Q型超纯水仪；0.22 μm有机系滤膜(美国安捷伦公司)。

1.2 标准溶液的配制

分别准确称取25种农药标准品各10.00 mg于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成质量浓度为1 000 mg/L的标准储备液。临用时，根据试验需要，用乙腈或薏仁米空白基质溶液稀释混合标准溶液，配成不同质量浓度的标准工作溶液。

1.3 基质效应

薏仁米基体比较复杂，含有大量淀粉等共提取物，在前处理过程中，薏仁米样品中的共提取物与目标化合物一同进入质谱系统，会对目标化合物的离子化程度产生一定影响，造成响应信号的降低或提高。为了有效减少干扰物，本文采用优化前处理方法，采用基质校准曲线的斜率(km)与纯溶剂标准曲线的斜率(ks)之比值来评价基质效应，根据公式ME=km/ks计算基质效应(ME)。当0.8＜ME＜1.2时为弱基质效应，可以接受；当ME＜0.8时为基质抑制效应；当ME＞1.2时为基质增强效应[17]。

1.4 色谱测定条件

色谱条件：Waters ACQUITY UPLC CSH C18柱(2.1mm×100 mm, 1.7 μm)；柱温：40 ℃；进样体积：2.0 μL；流速：0.3 mL/ min。流动相A：水(含0.1%甲酸及10 mmol/L甲酸铵)，流动相B：甲醇；梯度洗脱程序：0~1 min，60%~55% A；1~3 min，55%~50% A；3~6 min，50%~25% A；6~7 min，25%~10% A；7~9 min，60% A；

质谱条件：采用正离子扫描，电喷雾离子源 (ESI)；毛细管电压：3.0 kV；锥孔反吹气为氮气，流速：150 L/h；碰撞气为氩气，压力为 230 kPa；脱溶剂气体流速：800 L/h；脱溶剂温度：500 ℃；离子源温度：150 ℃。多反应监测模式 (MRM)，具体质谱参数见表2。0.05 mg/L混合标准溶液的MRM色谱图见图1。

图1 MRM模式下25种除草剂混合标准溶液(0.05 µg/mL)的总离子流色谱图

表1 25种除草剂的质谱检测条件

续表1

1.5 样品前处理

称取已粉碎的薏仁米样品5.0 g(精确至0.1 g)于50 mL离心管中，加入10.0 mL 水和 20.0 mL的乙腈(含1%甲酸)，涡旋5 min；加入3.0 g 氯化钠，涡旋 2 min，8 000 r/min离心5 min；取上清液2.0 mL于含有80 mg C18、200 mg无水MgSO4的10 mL离心管中，涡旋2 min，8 000 r/min离心5 min，取上清液过滤膜供UPLC-MS/MS分析。

2 结果与分析

2.1 色谱及质谱条件的选择

通过比较ESI正/负离子检测模式下25种除草剂质谱的响应值，进入一级质谱后，25种除草剂在ESI+模式下均可得到稳定的[M+H]+离子峰，且其响应值会明显优于负离子模式，SIM模式下扫描，进一步优化子离子、锥孔电压以及碰撞能量等质谱条件，每种除草剂选择2个响应值高且稳定的子离子，其中响应信号较强的子离子作为定量子离子。

分别比较了不同类型的色谱柱(Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm)、 Waters ACQUITY UPLC CSH C18柱(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm)、Waters ACQUITY UPLC HSST3柱(2.1 mm ×100 mm, 1.8 μm)对目标化合物的分离效果，发现CSH C18色谱柱的分离效果、峰型、响应值最佳。

由于磺酰脲类除草剂有弱酸性，在流动相中加入适量的甲酸和缓冲盐，提高电喷雾的离子化效率，增加各组分在固定相上的保留，并改善色谱峰形。本试验考察了乙腈-水(含0.1%甲酸)、甲醇-水(含0.1%甲酸)、甲醇-水(含0.1%甲酸及2 mmol/L甲酸铵)、甲醇-水(0.1%甲酸及10 mmol/L甲酸铵)流动相体系对25种目标化合物色谱分离的影响。比较乙腈-水(含0.1%甲酸)与甲醇-水(含0.1%甲酸)作为流动相的分离效果，发现目标化合物在甲醇-水(含0.1%甲酸)中分离效果较好。比较甲醇-水(含0.1%甲酸)、甲醇-水(含0.1%甲酸及2 mmol/L甲酸铵)、甲醇-水(含0.1%甲酸及5 mmol/L甲酸铵)、及甲醇-水(含0.1%甲酸及10 mmol/L甲酸铵)作为流动相的效果，发现甲醇-水(含0.1%甲酸)、甲醇-水(含0.1%甲酸及2 mmol/L甲酸铵)、甲醇-水(含0.1%甲酸及5 mmol/L甲酸铵)作为流动相时，吡嘧磺隆与环丙嘧磺隆，啶嘧磺隆与苄嘧磺隆，甲嘧磺隆与甲磺隆之间的分离效果差，在甲醇-水(含0.1%甲酸及10 mmol/L甲酸铵)流动相体系中分离好，色谱峰尖锐且对称。因此，最终选择甲醇-水(含0.1%甲酸及10 mmol/L甲酸铵)溶液作为流动相，流速为0.3 mL/min，进行梯度洗脱。

2.2 前处理方法的选择

考虑到薏仁米样品中含水量低这一特点，为了改善提取和净化效果，预先向已粉碎的薏仁米样品中加入适量的水，以利于极性的磺酰脲类除草剂的提取，从而提高农药的回收率。比较加水量5.0、10.0、15.0 mL对回收率的影响，结果表明，加水量为10.0 mL最合适。磺酰脲除草剂呈弱酸性，在酸性环境易从水中萃取到有机溶剂中，在提取溶剂的选择上，比较了乙腈、甲醇、乙腈(含1%甲酸)对目标化合物的提取效率。以甲醇为提取溶剂时，25种目标化合物的回收率为52.0%~80.0%；以乙腈为提取溶剂时，目标化合物的回收率为84.0%~93.2%；以乙腈(含1%甲酸)为提取溶剂时，目标化合物的回收率为85.0%~ 103%，乙腈中加入1%(体积分数)甲酸，可提高对碱性敏感农药(如单嘧磺隆)的回收率。因此，最终选择乙腈(含1%甲酸)作为提取试剂。

2.3 净化条件的优化

薏仁米基质较为复杂，含有较多的淀粉和油脂，提取目标化合物的同时，也提取出大量的油脂色素等杂质，因此提取液需要进一步纯化。GCB、PSA及C18是QuEChERS方法中常用的净化剂，GCB可以去除叶绿素等大分子杂质，但会吸附某些具有环状结构的农药；C18对非极性物质，有较高的容量，对色素、甾醇和维生素的去除能力较强；PSA可以有效地去除样品中的极性有机酸、脂类和糖类。试验对比了GCB、PSA及C18净化的效果。发现当使用PSA、GCB时，提取液的净化效果较好，但目标化合物的回收率较低；使用C18时，提取液的净化效果及回收率较好。对比了不同质量(40、60、80、100 mg) C18对目标化合物回收的影响，发现C18在40~80 mg范围内，各目标化合物回收率随着C18用量的增加缓慢升高，回收率达到83%~102%；当C18用量为80~100 mg时，各目标化合物的回收率下降。综合考虑，选用80 mg C18作为净化剂，净化效果和回收率均能满足残留试验要求。

2.4 方法的线性关系、定量限及基质效应

用空白基质提取液配制系列基质匹配标准工作溶液，按1.3节条件，经超高效液相色谱-串联质谱测定后，以目标化合物的峰面积(y)与对应的质量浓度(x)绘制标准曲线。以10倍信噪比计算方法的定量限(LOQ)。目标物的线性相关系数(r)为0.998 6~0.999 4，定量限为0.017~1.41 µg/kg，能够满足薏仁米中磺酰脲除草剂定量分析的基本要求。ME为0.83~1.13，基质效应不明显，可以忽略，具体结果见表2。

2.5 方法的准确度和精密度

选取薏仁米空白样品，添加不同水平的3个浓度进行添加回收试验，每个添加水平重复7次，按上述所述前处理方法及条件进行测定，计算25种磺酰脲类除草剂的平均添加回收率及相对标准偏差(RSD)，结果见表3。可见，25种磺酰脲类除草剂的平均添加回收率为89.5%~103.2%，相对标准偏差(RSDs) 1.7%~7.5%，说明该分析方法准确性和精密度满足薏仁米中25种磺酰脲类除草剂残留分析的要求。

2.6 实际样品测定

采用本研究建立的方法对100份实际薏仁米样品进行检测，结果表明样品均无除草剂检出，此方法适用于薏仁米中磺酰脲类除草剂多残留的筛查。

表2 25种除草剂的线性关系、定量限及基质效应

表3 25种磺酰脲类除草剂在薏仁米中的平均添加回收率和相对标准偏差(RSDS)(n=7)

续表3

3 结 论

建立了一种应用超高效液相色谱-串联质谱技术结合QuEChERS前处理技术，同时快速测定薏仁米中25种磺酰脲类除草剂的分析方法。该方法通过色谱柱、流动相、提取溶剂的优化，使磺酰脲类除草剂分离效果更好、响应值更高及峰形更好；在薏仁米样品中加入适量超纯水，保证了薏仁米中各磺酰脲类除草剂残留的充分提取，提高了提取效率；选用 UPLC-MS/MS多反应监测模式(MRM)实现了检测的高灵敏度和高准确度。说明本研究建立的该方法具有前处理简单、分析时间短、准确度和灵敏度高以及基质效应不明显等特点，适于薏仁米样品中磺酰脲类除草剂的实际检测需要。