高效液相色谱法测定饲料及宠物食品中牛磺酸

侯林丛，李贤，陆静，单慧燕，王彩杰，兰尊海*

（1.河南海瑞正检测技术有限公司,河南郑州450001;2.河南工业大学生物工程学院）

牛磺酸又称β-氨基乙磺酸，最早由牛黄中分离出来，故得名。牛磺酸是一种含硫的非蛋白氨基酸，在动物体内以游离状态存在，不参与体内蛋白的生物合成，但与胱氨酸、半胱氨酸的代谢密切相关。大量的畜禽研究表明，牛磺酸具有提高畜禽生长、繁殖性能，促进机体脑组织发育，增强机体免疫力，提高神经传导。近年来，牛磺酸在猪、鸡、水产饲料及饲料添加剂和宠物食品中被广泛应用，随着人类对牛磺酸功能的不断探索和认识，牛磺酸的市场潜力不断扩大。因此建立牛磺酸的测定方法具有重要意义[1～3]。

目前牛磺酸的测定方法主要有中和滴定法[4～5]、离子色谱法[6]、分光光度法[7～11]、电位滴定法[12～13]、高效液相色谱法[14～22]、薄层色谱法[23]、液相色谱串联质谱法[24～27]、氨基酸自动分析仪法等[28～30]。其中分光光度法是传统方法，操作复杂，所需试剂较多，结果有偏差故而不能广泛应用，氨基酸自动分析仪法对仪器和人员的要求较高，在一定程度上增加了检测的成本。本方法在大量实验基础上优化了牛磺酸的高效液相色谱法测定条件，以期为基层检测机构及饲料生产企业的检验人员提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

e2695高效液相色谱仪，配紫外检测器购自沃特世科技（上海）有限公司；BSA224S分析天平购自赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；电热恒温干燥箱购自上海一恒科学仪器有限公司；超声波购自昆山超声仪器；离心机购自安徽嘉文仪器装备有限公司；混匀器购自江苏新康医疗器械有限公司。

牛磺酸标准品（纯度≥99%）购自北京坛墨质检科技有限公司；甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、醋酸钠（优级纯）、碳酸氢钠（分析纯）、磷酸二氢钠（分析纯）、N，N-二甲基甲酰胺（分析纯）、亚铁氰化钾（分析纯）、乙酸锌（分析纯）；2，4-二硝基氟苯(DNFB)；实验用水为蒸馏水、高纯水。

配合饲料、浓缩饲料、饲料添加剂、宠物食品等均为客户委托检验的样品。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液的配制。亚铁氰化钾溶液：150g/L；乙酸锌溶液：30g/L；磷酸盐缓冲液（pH=7）：称取磷酸二氢钠3.4 g于500 mL容量瓶中，加入0.1 moL/L氢氧化钠145.5 mL，用水定容；醋酸钠缓冲液（0.05 moL/L）：称取3.4 g醋酸钠，加入800 mL超纯水，10 mL N，N-二甲基甲酰胺，用20%冰醋酸调pH至6.4，经0.45μm滤膜过滤，即得。

1.2.2 标准溶液的配制。牛磺酸标准贮备液（1mg/mL）：准确称取100 mg牛磺酸标准品于100 mL棕色容量瓶中，用水溶解定容，摇匀配制成标准贮备液，4℃密封避光保存，有效期6个月。牛磺酸标准使用液：分别移取一定体积的牛磺酸标准贮备液于100 mL棕色容量瓶中，用水定容，配制成2.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0μg/mL系列标准工作溶液，现用现配。

1.2.3 样品前处理

1.2.3.1 样品溶液的制备。精密称取样品适量（精确到0.0001 g），置于100 mL容量瓶中，加70 mL水，超声提取20分钟，放冷，加1mL亚铁氰化钾溶液，混匀，再加入1mL乙酸锌溶液，混匀，用水定容至刻度，摇匀，取上清液以4000 r/min离心10min，备用。

1.2.3.2 衍生反应.精密吸取标准溶液和样品溶液各10μL于杜氏小管中，抽干，依次加入0.5 moL/L碳酸氢钠溶液20μL、1%2，4-二硝基氟苯(DNFB)乙腈溶液20μL，混匀，置于60℃电热恒温干燥箱中避光衍生35min，取出，稍冷，加入磷酸盐缓冲液（pH=7）160μL，混匀，用微孔滤膜过滤，取10μL进样。

1.2.4 色谱条件。色谱柱：C18柱，长250 mm，内径4.5 mm，粒径5μm；流动相：醋酸钠缓冲液∶乙腈（85∶15,V∶V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：360nm；柱温：30℃；进样量：10μL。

1.2.5 计算公式

式中：X—样品中牛磺酸的含量,mg/kg；

c—由标准曲线得出的试样溶液中牛磺酸的质量浓度,μg/mL；

V—试样定容体积,mL；

m—试样质量,g。

2 结果与分析

2.1 前处理条件的优化

2.1.1 衍生试剂的选择。本研究在选择衍生试剂时，比较了2，4-二硝基氟苯(DNFB)、丹磺酰氯、邻苯二甲醛等几种衍生试剂的特点，其中邻苯二甲醛是测定游离氨基酸最常用的一种衍生化试剂，其灵敏度高，但是存在衍生物不稳定、衍生化时间要求苛刻等缺陷。在考虑到实验误差的问题上，选用了2，4-二硝基氟苯(DNFB)作为衍生试剂，3组不同衍生试剂的特点见表1。

表1 不同衍生试剂的特点

2.1.2 衍生时间的选择。本研究选择衍生时间时，比较了15min、35min、60min三种不同时间的衍生结果，衍生结果排序为60min≥35min＞15min，在考虑到实验效率的问题上，选用了35min作为衍生时间，3组样品不同衍生时间的回收率及相对标准偏差结果见表2。

表2 不同衍生时间的结果 min、%

2.1.3 流动相的选择。本研究比较了醋酸钠缓冲液∶乙腈（85∶15,V∶V）、醋酸钠缓冲液∶乙腈（60∶40,V∶V）、醋酸钠缓冲液∶乙腈（40∶60,V∶V）3种流动相对标准溶液及样品溶液进行分离测定，通过调节流动相中各组分的比例，使流动相的极性发生变化，改变分离效率，结果表明，不同流动相的色谱峰保留时间及峰型各有不同，随着乙腈比例的增大，牛磺酸保留时间不断提前，峰型变得尖锐。当流动相为醋酸钠缓冲液∶乙腈（85∶15,V∶V）时，色谱峰峰型较好，保留时间为15 min左右，牛磺酸标准溶液和样品溶液色谱图见图1、图2。

图1 牛磺酸标准溶液色谱图

图2 牛磺酸样品溶液色谱图

2.2 方法的线性关系和检出限

分别移取标准使用溶液注入高效液相色谱仪中，以其浓度值为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。浓度范围在2.0～100.0μg/mL时，溶液浓度和色谱峰面积呈现良好的线性关系，Y=2870.8X-869.12，r2=0.9999。

取空白样品，按照样品处理程序处理后上机测定。另取多份空白样品，加入不同的较低浓度的牛磺酸标准工作液，按照样品处理程序处理后上机测定，对比结果，将引起3倍信噪比时的浓度定义为方法检出限，当样品称样量为2 g时，该方法检出限为5.0 mg/kg，方法灵敏度较高。

2.3 方法精密度

选取配合饲料、浓缩饲料、饲料添加剂、宠物食品等4种不同的产品进行精密度试验（n=6），测定结果见表3，可以看出，4种不同产品的RSD均不大于5.0%，说明该方法的准确度较高。

表3 精密度测定结果 mg/kg、%

2.4 稳定性试验

将同一样品衍生液放置24h、48 h和96h，分别取这3个时间段的衍生液，平行3次进行上机测定，结果表明，样品衍生液密闭冷藏放置48 h内，牛磺酸结果变化不大，牛磺酸色谱峰面积及相对标准偏差（RSD）见表4。

表4 稳定性测定结果 h、%

2.5 回收率实验结果

取同一基质的样品为本底样品，分别添加2.0、5.0、10.0 mg/kg 3个不同浓度的牛磺酸标准溶液，按照本方法进行实验操作，平行测定3次，回收率在90.8%～95.8%之间，RSD为1.08%～2.73%，方法回收率较高，详见表5。

表5 回收率测定结果 mg/kg、%

3 结论与讨论

本研究建立了饲料及宠物食品中牛磺酸的高效液相色谱测定方法。通过对样品处理和实验条件进行了优化，分别对配合饲料、浓缩饲料、饲料添加剂、宠物食品等4种不同的样品进行了精密度、准确度及灵敏度实验，测得6组数据的相对标准偏差在1.36%～3.60%之间，不同添加量的平均回收率在90.8%～95.8%之间，方法的检出限为5.0 mg/kg。优化后的方法重复性好，准确度高，基质干扰小。通过实际样品的检测，说明该方法有较广泛的适用范围，除配合饲料、浓缩饲料和饲料添加剂之外，也适用于宠物食品中牛磺酸的检测。