基于核转录因子κB信号通路探讨益气固表丸治疗慢性阻塞性肺疾病的疗效研究

罗建江，张艳丽，刘珊

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是临床常见的一种慢性呼吸系统疾病，以气道、肺实质和肺血管慢性炎症为主要特征，患病率较高，且病情易反复加重，严重影响患者的劳动能力和生活质量［1-2］。炎症是COPD的主要机制［3］。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革兰阴性菌细胞壁的主要成分，可黏附于支气管黏膜的上皮细胞，进而刺激中性粒细胞及单核细胞释放白介素（interleukin，IL）-1、IL-6、肿瘤坏死因 子 α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）等细胞因子，激活信号通路释放各种自由基、水解酶等，进而导致肺损伤，造成炎症级联反应［4-5］。既往研究发现，中药复方制剂——益气固表丸可有效降低COPD患者IL-6、TNF-α水平［6］。核因子激活的核转录因子κB（nuclear transcription factor κB，NF-κB）是IL-6和 TNF-α基因的调控信号途径，但LPS是如何通过NF-κB信号通路来诱导COPD尚不明确。基于此，本研究旨在探讨益气固表丸通过阻断LPS/NF-κB信号通路来抑制COPD的分子机制，以期为益气固表丸治疗COPD提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验时间 2017年7月—2018年6月。

1.2 实验动物 本实验选取了8周龄的SPF级SD雄性大鼠48只，平均体质量（190±10）g，均于2017年7月购于新疆医科大学实验动物中心，动物质量合格证书：SCXK（新）2016-0002。饲养环境：模拟自然昼夜条件，室温20～25 ℃，相对湿度为50%～65%，环境安静，定时换窝。通过气管滴注弹性蛋白酶、LPS以建立COPD大鼠模型，并通过检查其炎性因子和肺功能进一步确定建模是否成功。按照随机数字表法将所有COPD大鼠分为空白对照组、模型组、益气固表丸高剂量组、益气固表丸低剂量组，每组12只。本研究经新疆医科大学伦理委员会审核批准。

1.3 试剂与仪器 试剂：益气固表丸（新疆制药厂生产，生产批号：20121212）购于新疆医科大学附属中医医院中心药房；LPS购于美国Sigma公司；IL-6、TNF-α均采用酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测，试剂盒购于上海联科生物医药有限公司；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）引物购于生工生物工程（上海）股份有限公司；DNA反转录试剂盒购于北京全式金生物技术有限公司；IκBα、p-IκBα抗体均购于北京博奥森生物技术有限公司。仪器：多功能酶标仪购于Bio-RadBio-Rad（伯乐生命医学产品）有限公司；实时荧光定量PCR仪购于Bio-Rad有限公司；化学发光成像仪系统（Chemiscope 3000）购于上海勤翔科学仪器有限公司。

1.4 模型制备及治疗 大鼠适应性喂养1周后，气道滴注弹性蛋白酶联合LPS以建立COPD大鼠模型［7］，具体方法如下：大鼠均予以10%水合氯醛进行腹腔麻醉，而后模型组、益气固表丸高剂量组、益气固表丸低剂量组大鼠均于气道内给予猪胰弹性蛋白酶4.2 U，1周后再气道滴注LPS 100 μl，1次/10 d，持续给药10次。空白对照组大鼠仅于气道内喷相同剂量的0.9%氯化钠溶液。

确定建模成功后，益气固表丸高剂量组大鼠给予益气固表丸200丸+0.9%氯化钠溶液500 ml进行治疗；益气固表丸低剂量组大鼠给予益气固表丸100丸+0.9%氯化钠溶液500 ml进行治疗，大鼠均按照1.5 ml∶100 g的比例进行灌胃，2次/d，持续治疗14 d；空白对照组和模型组大鼠则给予相同剂量的0.9%氯化钠溶液，且采用相同的灌胃频率处理。

1.5 观察指标

1.5.1 肺组织病理变化情况 观察大鼠肺组织病理变化情况。建模后第2天，四组大鼠均予以10%水合氯醛进行腹腔麻醉，而后迅速开胸剥离肺组织，在垂直于支气管的左侧肺矢状面最大周径处取厚约5 mm的肺组织，用10%甲醛溶液固定，制作石蜡组织切片，用苏木精-伊红（HE）染色后在显微镜下观察四组大鼠肺组织病理变化情况。

1.5.2 血清TNF-α、IL-6水平 比较四组大鼠血清TNF-α、IL-6水平。抽取四组大鼠血液，4 000 r/min离心10 min（离心半径6 cm），取上清液，采用ELISA检测血清TNF-α、IL-6水平，具体操作严格按试剂盒说明书进行，具体操作步骤如下：（1）准备好所有需要的试剂及工作浓度标准品。（2）将不需要的板条拆卸下来，放回装有干燥剂的铝箔袋，重新封口。（3）加入300 μl洗液静置、浸泡30 s，弃掉洗液后，在吸水纸拍干微孔板；洗板完成后，立即使用微孔板，不要让微孔板干燥。（4）标准孔加入100 μl 2倍比稀释的标准品，空白孔加入100 μl标准品稀释液。（5）样本孔加入100 μl血清样本。（6）每孔加入50 μl稀释的检测抗体。保证步骤4、5、6连续加样，不间断。加样过程在15 min内完成。（7）使用封板膜封板。300 r/min振荡，室温孵育2 h。（8）弃掉液体，每孔加入300 μl洗液洗板，洗涤6次。每次洗板在吸水纸上拍干。（9）每孔加入100 μl稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。（10）使用新的封板膜封板。300 r/min振荡，室温孵育45 min。（11）重复步骤8。（12）每孔加入100 μl TMB底物显色试剂盒，避光，室温孵育5～30 min。（13）每孔加入100 μl终止液。（14）在30 min内，使用酶标仪进行双波长检测，测定450 nm最大吸收波长和570 nm参考波长下的OD值。校准后OD值为450 nm处OD值与570 nm处OD值的差。

1.5.3 RelA（p65）、NF-κB1（p53）基因相对表达量 比较四组大鼠RelA（p65）、NF-κB1（p53）基因相对表达量。麻醉处死大鼠后，快速采集肺组织，组织样本经液氮研磨后取100 mg置于离心管中，加入1 ml TRLZOL将组织吹打、混匀，室温放置15 min以上；而后加入200 μl的氯仿，颠倒混匀后室温放置2～5 min，再在4 ℃环境下以12 000 r/min的转速离心处理15 min（离心半径10 cm），而后取上清液置于一个新的离心管中，加入等体积的异丙醇混匀，并于-20 ℃环境下静置30 min以上，再在4 ℃环境下以12 000 r/min的转速离心处理15 min（离心半径10 cm），倒掉上清液；加入75%乙醇，使沉淀漂浮起来洗涤；再在4 ℃环境下以12 000 r/min的转速离心处理15 min（离心半径10 cm），倒掉上清液，吸尽液体，晾干；用无RNA、DNA酶的水溶解沉淀。进行1.8%琼脂糖凝胶电泳，150 V，10 min，电泳完毕后应用凝胶成像仪进行观察。剩余RNA置于-80 ℃环境下保存或直接反转录成cDNA，再进行实时荧光定量反转录-聚合酶链式反应（rRT-PCR），实时荧光定量PCR引物序列见表1，观察四组大鼠RelA（p65）、NF-κB1（p53）基因相对表达量。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.5.4 IκBα、p-IκBα蛋白相对表达量 采用Western blotting法检测四组大鼠IκBα、p-IκBα蛋白相对表达量。麻醉处死大鼠后，快速提取肺组织，匀浆，经液氮研磨后取约100 mg的肺组织加入到预冷的1.5 ml离心管中，然后加入400 μl RIPA裂解液（已加入蛋白酶抑制剂和广谱磷酸酶抑制剂）充分混匀，在4 ℃环境下放置60 min后，12 000 r/min离心15 min（离心半径10 cm），取上清液，提取白蛋白。用蛋白质定量法测定蛋白浓度。将已电泳后的聚丙烯酰胺凝胶用考马斯亮蓝染色60 min。蛋白样本中加入适量十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）试剂loading buffer（含β-巯基乙醇），100 ℃沸水中加热5 min，使蛋白充分变性，12 000 r/min离心5 min（离心半径10 cm），取上清液备用。配制12%、15%分离胶与5%浓缩胶，依次进行制胶、加样、电泳、转膜、一抗抚育、二抗抚育、曝光，显影、定影。结果扫描后，经光密度分析系统计算灰度值。

1.6 统计学方法 应用SPSS 22.0统计学软件进行数据处理。符合正态分布的计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组大鼠肺组织病理变化情况 HE染色结果显示，空白对照组大鼠肺组织大体结构基本正常；模型组大鼠肺组织肺泡壁增生、增厚，伴细胞增大、增多，间质炎症细胞浸润，部分肺泡萎缩或扩张，支气管上皮细胞部分增生及缺损，黏膜下大量慢性炎症细胞浸润，有较多出血、坏死区；与模型组相比，益气固表丸低剂量组大鼠肺组织改善并不明显，而益气固表丸高剂量组大鼠肺泡增生、增厚，支气管病变有所好转，见图1。

图1 四组大鼠肺组织病理变化情况Figure 1 Pathological changes of lung tissue in the four groups of rats

2.2 四组大鼠血清TNF-α、IL-6水平比较 四组大鼠血清TNF-α、IL-6水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。模型组、益气固表丸低剂量组大鼠血清TNF-α、IL-6水平及益气固表丸高剂量组血清TNF-α水平高于空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；益气固表丸高剂量组大鼠血清TNF-α、IL-6水平低于模型组及益气固表丸低剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 四组大鼠血清TNF-α、IL-6水平比较（±s，pg/ml，n=12）Table 2 Comparison of serum levels of TNF-α，IL-6 in the four groups of rats

表2 四组大鼠血清TNF-α、IL-6水平比较（±s，pg/ml，n=12）Table 2 Comparison of serum levels of TNF-α，IL-6 in the four groups of rats

注：与空白对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与益气固表丸低剂量组比较，cP＜0.05；TNF-α=肿瘤坏死因子α，IL-6=白介素6

组别 TNF-α IL-6空白对照组 1.52±1.09 5.02±3.43模型组 9.13±1.66a 37.64±13.06a益气固表丸低剂量组 9.19±1.61a 24.17±8.31a益气固表丸高剂量组 4.14±1.78abc 5.17±3.94bc F值 35.923 22.994 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.3 四组大鼠RelA（p65）、NF-κB1（p53）基因相对表达量比较 四组大鼠RelA（p65）、NF-κB1（p53）基因相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。模型组、益气固表丸低剂量组大鼠RelA（p65）、NF-κB1（p53）基因相对表达量高于空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；益气固表丸高剂量组大鼠RelA（p65）、NF-κB1（p53）基因相对表达量低于模型组，RelA（p65）基因相对表达量低于益气固表丸低剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 四组大鼠RelA（p65）、NF-κB1（p53）基因相对表达量比较（±s，n=12）Table 3 Comparison of the gene relative expression of RelA（p65） and NF-κB1（p53） in the four groups of rats

表3 四组大鼠RelA（p65）、NF-κB1（p53）基因相对表达量比较（±s，n=12）Table 3 Comparison of the gene relative expression of RelA（p65） and NF-κB1（p53） in the four groups of rats

注：与空白对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与益气固表丸低剂量组比较，cP＜0.05

组别 RelA（p65） NF-κB1（p53）空白对照组 1.02±0.22 1.01±0.11模型组 1.66±0.14a 1.76±0.19a益气固表丸低剂量组 1.48±0.25a 1.59±0.31a益气固表丸高剂量组 1.21±0.21bc 1.19±0.16b F值 10.003 17.249 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.4 四组大鼠IκBα、p-IκBα蛋白相对表达量比较四组大鼠IκBα蛋白相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。四组大鼠p-IκBα蛋白相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。模型组、益气固表丸低剂量组大鼠p-IκBα蛋白相对表达量高于空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；益气固表丸高剂量组大鼠p-IκBα蛋白相对表达量低于模型组及益气固表丸低剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4、图2。

图2 Western blotting法检测IκBα、p-IκBα蛋白相对表达量的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳图Figure 2 SDS-PAGE of relative expression of IκBα and p-IκBα protein detected by Western blotting

表4 四组大鼠IκBα、p-IκBα蛋白相对表达量比较（±s，n=12）Table 4 Comparison of the protein relative expression of IκBα and p-IκBα in the four groups of rats

表4 四组大鼠IκBα、p-IκBα蛋白相对表达量比较（±s，n=12）Table 4 Comparison of the protein relative expression of IκBα and p-IκBα in the four groups of rats

注：与空白对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与益气固表丸低剂量组比较，cP＜0.05

组别 IκBα蛋白相对表达量p-IκBα蛋白相对表达量空白对照组 0.54±0.04 0.31±0.07模型组 0.56±0.01 0.74±0.04a益气固表丸低剂量组 0.56±0.02 0.63±0.10a益气固表丸高剂量组 0.54±0.04 0.43±0.05bc F值 0.794 24.935 P值 0.530 ＜0.001

3 讨论

COPD气道慢性炎症发生的中心环节是炎症细胞局部趋化、激活以及大量相关炎性递质的释放［8］，长期反复发作可导致患者肺损伤及肺功能恶化，最终引发呼吸衰竭甚至死亡。研究表明，西药虽可控制COPD患者现有症状、缓解急性加重症状，但均不能逆转肺损伤［9］，目前传统中医药治疗COPD逐渐得到重视。

中医学理论认为，COPD属“肺胀”范畴。COPD是本虚标实，日久肺气亏虚，病及脾肾，故益气固表、健脾燥湿是其主要治疗原则。本院研制的复方制剂——益气固表丸是由茯苓、陈皮、（炒）白术、法半夏、浮小麦、薏苡仁、蜜枇杷叶、黄芩、防风、紫苏子、伊贝母、党参、蜜款冬花13味中药构成的丸剂，具有抗炎、抗氧化、调节机体免疫力的作用，能有效缓解COPD患者喘、咳、痰、胀等不适，减少患者急性加重，降低再住院率［10-11］。

COPD的主要致病菌是革兰阴性菌［12］。LPS是革兰阴性菌细胞壁的主要成分，具有广泛生理活性，可与巨噬细胞、单核细胞和树突状细胞膜上的CD14/TLR4/MD2复合物结合并通过MyD88/TAK1等激活NF-κB通路，促进细胞分泌促炎因子、一氧化氮（NO）等多种细胞因子，而弹性蛋白酶作用于气道弹性蛋白时可激活肺泡巨噬细胞，引起炎性因子表达增加［13］。本研究在建模过程中不仅对大鼠气管滴注弹性蛋白酶，还结合LPS反复刺激气道产生慢性炎症反应，从而成功建立COPD大鼠模型，结果显示，空白对照组大鼠肺组织大体结构基本正常；模型组大鼠肺组织肺泡壁增生、增厚，伴细胞增大、增多，间质较多慢性炎症细胞浸润，部分肺泡萎缩或扩张，支气管上皮细胞部分增生及缺损，黏膜下大量慢性炎症细胞浸润，较多出血、坏死区，表明COPD大鼠建模成功。另外，益气固表丸低剂量组较模型组肺组织病变差异不明显；益气固表丸高剂量组与模型组比较，肺泡增生、增厚及间质炎症细胞浸润程度均有所改善，肺泡萎缩及肺泡壁断裂、扩张程度均减轻，支气管病变有所好转，表明高剂量益气固表丸可有效减轻COPD大鼠肺组织损伤程度，改善炎症细胞浸润程度。本研究结果还显示，模型组、益气固表丸低剂量组大鼠血清TNF-α、IL-6水平及益气固表丸高剂量组血清TNF-α水平高于空白对照组；益气固表丸高剂量组大鼠血清TNF-α、IL-6水平低于模型组及益气固表丸低剂量组，表明益气固表丸高剂量治疗较低剂量可更有效地减轻COPD大鼠炎症反应。金晶等［14］研究表明，益气固表丸可抑制JKA/STAT通路及其下游炎症蛋白的活化与表达，改善COPD大鼠肺内炎症反应。另有研究表明，益气固表丸可改善肺脾气虚型COPD稳定期患者机体免疫功能［15］，但其具体机制尚未明确。

NF-κB是人体重要的转录调节因子，是由多个多肽亚单位组成的蛋白家族［16］。RelA（p65）、IκB、p-IκB皆是NF-κB家族的重要成员。当无活化刺激信号时，RelA可与细胞质内的IκB结合形成复合物；支气管上皮细胞在LPS刺激下释放的炎性因子如IL-1、IL-6可激活NF-κB通路，IκB激酶复合物IKK可使IκB磷酸化，生成p-IκB，进而激活RelA/IκB复合物使其分离，游离的RelA进入细胞核内调节相关炎性因子表达［17］。本研究结果显示，模型组、益气固表丸低剂量组大鼠RelA（p65）、NF-κB1（p53）基因相对表达量高于空白对照组；益气固表丸高剂量组大鼠RelA（p65）、NF-κB1（p53）基因相对表达量低于模型组，RelA（p65）基因相对表达量低于益气固表丸低剂量组；模型组、益气固表丸低剂量组大鼠p-IκBα蛋白相对表达量高于空白对照组；益气固表丸高剂量组大鼠p-IκBα蛋白相对表达量低于模型组及益气固表丸低剂量组，表明益气固表丸高剂量治疗可更有效地降低COPD大鼠RelA（p65）基因相对表达量及p-IκBα蛋白相对表达量，推测益气固表丸可通过抑制NF-κB信号通路中p-IκBα来阻断RelA（p65）进入细胞核激活基因的转录，减少炎性递质释放，从而减轻炎症反应。研究表明，COPD患者IL-1、IL-6与NF-κB基因相对表达量呈正相关，表明NF-κB与炎性因子可相互影响而加速局部炎症的发生发展［18-19］，本研究结果与之一致。

综上所述，高剂量益气固表丸可通过调控COPD大鼠体内的NF-κB信号通路及其下游RelA（p65）基因相对表达量、p-IκBα蛋白相对表达量而降低炎性细胞水平，进而减轻气道炎症反应。

作者贡献：罗建江进行文章的构思与设计，研究的实施与可行性分析，结果分析与解释，撰写论文，进行论文的修订；刘珊进行数据收集、整理、分析；张艳丽负责文章的质量控制及审校，并对文章整体负责、监督管理。

本文无利益冲突。