三唑酮及其代谢物残留检测的酶联免疫方法的建立

崔廷婷 万宇平陈立军崔娜崔海峰吴小胜

(1.北京勤邦生物技术有限公司，北京 102206；2.北京市食品安全免疫快速检测工程技术研究中心，北京 102206；3.滦州市农业农村局，河北 滦州 063701)

三唑酮是一种高效、低毒、广谱的内吸性杀菌剂，兼有保护、治疗、铲除和熏蒸等作用，可用于防治小麦的纹枯病、全蚀病、白粉病、根腐病，水稻的稻瘟病、稻叶尖枯病、稻曲病、黑粉病等多种病害[1]。其还是一种甾醇抑制剂和植物生长调节剂，在与一些农药混配后具有协同增效作用[2]。但大量使用该农药，会导致部分产地农作物中三唑酮检出率偏高，残留在农产品中的三唑酮会对人体产生危害[3,4]，也会影响我国农产品质量安全和出口贸易[5]。因此，三唑酮及其代谢物三唑醇在农产品中的残留检测受到了越来越多的关注。

目前，关于三唑酮及其代谢物三唑醇的残留检测方法多为气相色谱法[6-8]、液相色谱法[9]和色谱-质谱联用技术[10-13]。这些方法可以精确地进行定量分析，但设备昂贵、操作复杂，检测成本高、周期长，而且需要专业的人员，只能用于小批量样品抽检，无法满足对大批量样品进行现场、快速检测的需要。而酶联免疫吸附技术(ELISA)具有特异性高、敏感性强、快速方便、不需要昂贵仪器设备、检测成本低、适合于大批量样品的检测等优点，已在农兽药残留及微量毒素检测中被广泛应用。因此，本研究拟建立一种快速、灵敏检测烟草、蔬菜水果中三唑酮及其代谢物残留的酶联免疫吸附方法，旨在为农作物中农药残留的现场监控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

雌性Balb/c小鼠(6～8周龄)，清洁级，由北京勤邦生物技术有限公司实验动物室提供；1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、碳化二亚胺(EDC)、三唑酮、三唑醇(纯度≥99%)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)均购自Sigma公司；其它化学试剂为分析纯。复溶液为pH7.0、0.1mol·L-1的磷酸盐缓冲液。

1.2 仪器与设备

8010S匀浆机，上海斯伯明仪器设备有限公司；2000SBL电子天平，美国Setra公司；QL-901漩涡混合器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；Anke TDL-40B低速离心机，海安亭科学仪器有限公司；微量移液器(单道20～200μL、100～1000μL，多道20～300μL)，美国Thermo公司；DHP-600生化培养箱，天津市中环实验电炉有限公司；MK3酶标仪，美国Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 三唑酮半抗原的合成

合成路线见图1。取1.0g三唑酮加乙醇溶解，加入0.35g DBU，搅拌，再加入0.87g氨基己酸水溶液，加热回流反应12h；停止反应，旋蒸，除去乙醇，加水和1.3g氢氧化钾，震荡，加乙酸乙酯萃取，分去有机相，水相调节pH值到4，加乙酸乙酯萃取，有机相水洗，无水硫酸钠干燥蒸干，得到浅黄色油状物，二氯甲烷/石油醚(1∶10，V/V)重结晶，即得到三唑酮半抗原产物。其化学结构用核磁共振鉴定。

1.3.2 人工抗原的制备

将三唑酮半抗原与BSA和OVA分别偶联，作为免疫原和包被原。具体操作过程：取14mg半抗原，溶解于1mL DMF中；称取载体蛋白50mg，使之充分溶解在3.8mL MES缓冲液(pH5.0)中，将半抗原缓慢滴加到蛋白溶液中；取30mg EDC用0.2mL MES缓冲液(pH5.0)充分溶解后加入半抗原蛋白混合液中，室温下搅拌24h；用0.01mol·L-1PBS缓冲液4℃透析3d，每天换3次透析液；分装，于-20℃保存备用。

1.3.3 单克隆抗体的制备

按照常规方法免疫Balb/c小鼠制备腹水抗体，用饱和硫酸铵法纯化后备用[14]。

1.3.4 抗原、抗体最适工作浓度的确定

分别将包被原(三唑酮半抗原-卵清蛋白偶联物)和三唑酮单克隆抗体溶液倍比稀释，进行间接竞争ELISA方阵试验，选取OD450nm值在1.0左右的包被原和抗体浓度为最佳工作浓度。

1.3.5 间接竞争ELISA方法的建立

用包被缓冲液将包被原稀释成最佳工作浓度后，包被在96孔酶标板上，100μL/孔，37℃温育2h；倾去板中溶液，经PBST洗涤3次，加入封闭液200μL/孔，37℃温育2h；洗涤3次，加入系列浓度的三唑酮标准溶液50μL/孔，再加入经抗体稀释液稀释成最佳工作浓度的单克隆抗体溶液50μL/孔，25℃避光反应30min；洗涤4～5次后，加入酶标二抗100μL/孔，25℃避光反应30min；洗涤4～5次后加入底物液A液(过氧化脲)和B液(四甲基联苯胺)各50μL/孔，25℃显色15min，加入2mol·L-1H2SO4终止液50μL/孔，设定酶标仪于450nm处测定每孔吸光度值(OD值)。

信贷扶贫资金管理方面主要的创新有：第一，借款主体的创新，先后尝试了直接贷款到户、扶持经济实体、支持地方主导产业和龙头企业，以及直接贷款到户与委托帮扶贷款相结合等方式；第二，贷款方式创新，1986年以来尝试了政府信用下的经济实体贷款、依托社会信用的小额贷款、抵押和担保为基础的企业或政府贷款等；第三，贴息方式创新，尝试了贴息给承贷银行、贴息给借款人等方式；第四，承贷机构选择，先后尝试了商业银行承贷、政策银行承贷、地方政府选择等方式。

1.3.6 标准曲线的绘制

采用间接竞争ELISA方法建立标准曲线，分别选择三唑酮标准品浓度0μg·L-1、1μg·L-1、3μg·L-1、9μg·L-1、27μg·L-1、81μg·L-1，以浓度为0μg·L-1时的OD值为B0值，相应三唑酮浓度的OD值为B值，以百分吸光度值(B/B0)为纵坐标，标准品浓度的对数值为横坐标，绘制标准曲线。

1.3.7 样品前处理

1.3.7.1 烟草样本

称取1±0.05g均质的烟草样本至10mL聚苯乙烯离心管中，加入5mL乙腈，涡动3min混匀；4000r·min-1室温离心5min；取20μL样本液至4mL聚苯乙烯离心管中，加入1980μL复溶液，涡动30s，取50μL用于分析。

1.3.7.2 蔬菜水果样本

称取1±0.05g均质的果蔬样本至10mL聚苯乙烯离心管中，加入4mL乙腈，涡动3min混匀；4000r·min-1室温离心5min；取20μL样本液至4mL聚苯乙烯离心管中，加入1980μL复溶液，涡动30s，取50μL用于分析。

1.3.8 酶联免疫方法技术参数的确定

1.3.8.1 检测限试验

1.3.8.2 特异性试验

选择与三唑酮具有类似结构和类似功能的其它杀菌剂(三唑醇、环唑醇、粉唑醇、戊唑醇、己唑醇、烯唑醇)进行交叉反应性检测。计算交叉反应率：

交叉反应率=X/Y×100%

式中，X为引起50%抑制的三唑酮浓度；Y为引起50%抑制的其它杀菌剂浓度。

1.3.8.3 准确性和重复性试验

用回收率和变异系数分别来评价ELISA方法的准确性和重复性。以3个不同浓度的三唑酮、三唑醇标准品分别对空白样本进行添加回收试验，计算回收率和变异系数。

2 结果与分析

2.1 半抗原的核磁共振氢谱鉴定

取半抗原产物经核磁共振得图2。从图2可知，1H-NMR(CDCl3,300MHz)δ：11.00(1H,s)，7.51(1H,ddd,J=8.132,J=5.483,J=1.670)，7.46(1H,ddd,J=8.132,J=5.485,J=1.670)，6.94(1H,dd,J=8.132,J=5.485)，6.94(1H,dd,J=8.132,J=5.483)，6.52(1H)，8.270(1H,d,J=1.903)，8.1(1H,d,J=1.903)，3.87(2H,t,J=7.434)，1.25(3H,s)，1.25(3H,s)，1.25(3H,s)，1.84(2H,tt,J=7.434,J=7.022)，1.41(2H,tt,J=7.434,J=7.022)，1.55(2H,tt,J=7.434,J=7.367)，2.30(2H,t,J=7.367)。图谱中，化学位移δ=11.0的为间隔臂上羧基氢共振吸收峰；δ=1.85、1.41、2.30的为间隔臂上亚甲基氢的共振吸收峰，这些峰的存在，证明间隔臂偶联成功，三唑酮半抗原结构正确。

2.2 最佳工作浓度的选择

方阵法测定不同包被原和单克隆抗体的间接竞争抑制ELISA测定结果(OD450nm值)见表1。在ELISA包被过程中，包被效果与浓度呈正相关，但浓度过高，不仅浪费试剂，而且会降低待测物的竞争能力，从而影响灵敏度[16]。考虑到酶标仪测定OD450nm值的敏感范围在1.00左右，为了既保证测定结果的灵敏可靠，又减少抗原的用量，试验应选择的最适包被原稀释倍数为1∶10000，最佳抗体稀释倍数为1∶300000。

表1 不同包被原和单克隆抗体稀释浓度的OD450nm值

2.3 标准曲线的建立

以百分吸光度值(B/B0)为纵坐标(Y)，标准品浓度的对数值为横坐标(X)绘制标准曲线，如图3所示。以Logit(B/B0)为纵坐标，标准品浓度的对数值为横坐标，将图3转换后可知，在1～81μg·L-1浓度范围内，Logit(B/B0)与三唑酮浓度对数呈现良好的线性关系，如图4所示。建立拟合回归直线方程为Y=-2.175X+1.086，相关系数r为0.9950，半数抑制浓度(IC50)为3.0μg·L-1。

2.4 检测限测定

20个空白样本的B/B0在标准曲线上对应的浓度见表2，综合考虑几种样本的检测限数据，得出本方法对烟草和蔬菜水果样本的检测限为0.5mg·kg-1。

表2 方法的检测限测定结果

2.5 特异性测定

由于三唑醇是三唑酮的代谢产物，所以选用的三唑酮单克隆抗体与三唑醇有94.6%的交叉反应，而与其它类似结构的杀菌剂的交叉反应均<1%，说明该方法具有良好的特异性。

2.6 准确性和重复性测定

ELISA测定的准确度用回收率表示，精密度用变异系数表示。以市售空白烟叶、白菜、茄子、苹果、香蕉样本为试验材料，向其中分别添加三唑酮及其代谢物三唑醇标准品，添加量为0.5mg·kg-1、1.0mg·kg-1、2.0mg·kg-1。结果表明，样品加标回收率为73.6%～102.5%，重复检测结果的变异系数为5.8%～9.2%，说明该ELISA方法测定烟草、蔬菜水果中三唑酮及其代谢物三唑醇残留具有良好的准确性和重复性，可用于农作物中三唑酮及其代谢物三唑醇的残留检测。

3 结论

酶联免疫法因灵敏度高、特异性好、操作简便、检测成本低、一次性检测样本量大等特点，能够更好地满足我国食品企业、政府监管部门等开展检测工作。本研究初步建立了烟草和蔬菜水果中三唑酮及其代谢物三唑醇残留检测的酶联免疫吸附法。该方法的IC50为3.0μg·L-1，样本检测限为0.5mg·kg-1；阳性样本的加标回收率为73.6%～102.5%，样本重复检测结果的变异系数为5.8%～9.2%，并且样本前处理简单、仪器设备投资少、检测成本低，适用于大批量样本中三唑酮及其代谢物三唑醇残留的快速筛选。