广西西门塔尔肉牛超数排卵效果观察

文信旺， 贾银海， 潘 锐， 吴思谦， 黄 香*，戴黄山， 黄明光， 梁金逢， 周晓情， 王启芝

(1.广西壮族自治区畜牧研究所，南宁 530001；2.广西家畜遗传改良重点实验室，南宁 530001；3.广西融安县板榄镇水产畜牧兽医站 广西 融安 545400)

近年来，牛同期发情、超数排卵、胚胎移植等生物工程技术发展迅速，相关技术日臻成熟。牛的卵巢正常含有数十万个卵母细胞，正常情况下，每1个发情周期只有1个卵子成熟并参加受孕[1]。但为了获得更多可用卵子和胚胎，加快牛繁育进程，可以通过超数排卵技术得以实现。影响牛超数排卵效果因素较多，牛的品种、年龄、饲养管理、气候条件、药品种类、超排及采胚技术等。本次试验旨在分析广西肉牛繁育关键技术实施现状，探讨切实有效的技术，为助力广西肉牛产业脱贫攻坚打下坚实的基础。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验于2020年9—10月在广西宾阳、都安、大化、崇左4个肉牛养殖场各选择16头西门塔尔成年母牛进行超数排卵试验，试验牛生产性能良好，遗传稳定，系谱清楚，体格健康，无传染病,无繁殖性疾病，胎次在3胎以下。采用孕酮栓(GIOB)+促卵泡素(FSH)+氯前列烯醇(PGF2)的方法对试验母牛进行处理，试验牛使用的药品相同，处理流程相同，饲养管理方法相近，通过试验观察母牛超数排卵效果。

1.2 试验物品及器材

促卵泡素(FSH)，商品名为舒牛，100 IU/支×10，中国宁波第二激素厂生产；孕酮栓(GIOB)，澳大利亚Vetoquinol N.-A Inc公司生产，1.56 g/枚×10，北京比威克生物技术有限公司提供；氯前列烯醇钠(PGF2)，0.2 mg∶2 mL×10支/盒，济南齐鲁动物保健品公司生产；促黄体素释放激素A3(25 μg×10支)，宁波第二激素厂；冲胚液，1 000 mL/瓶，法国IMV卡苏公司生产；冷冻液，10 mL/瓶，法国IMV卡苏公司生产；保存液，10 mL/瓶，法国IMV卡苏公司生产；盐酸利多卡因注射液，10 mL×5支)，吉林华牧动物保健品有限公司生产。程序冷冻仪(型号CL80000)，澳大利亚Cryologic公司生产；实体显微镜，由德国卡尔蔡司公司(Carl Zeiss)生产，冲胚管、扩张品由北京比威克生物技术有限公司提供；除粘器、集卵杯、塑料注射器(20 mL，50 mL)、无菌培养皿、0.25 mL冷冻细管、移液器、装管器等均由南宁基诺公司提供。

1.3 试剂配制

FSH试剂配制：每10 mL生理盐水溶解100 IU促卵泡素(舒牛)，充分摇匀溶液，试剂即配即用。

1.4 超数排卵流程

超排方法：选择发情周期的任何一天在供体母牛阴道内埋植孕酮栓(作为试验第0天)，采用4 d递减法对牛肌肉注射FSH(见表1)，每天上、下午2次注射，间隔12 h，第11天上午试验牛注射0.5 mg PG，第12天撤掉试验母牛阴道内的孕酮栓。第13天上午、下午及第14天上午连续3次输精，在第13天上午输精后每头牛肌注50 mg促黄体素释放激素A3，第20天对试验牛子宫进行冲洗、收集胚胎、实验室镜检及鉴定分级。

表1 各组牛FSH 4 d递减法注射剂量及流程

输精要求：供体牛经过激素处理后，发情鉴定在第13天进入了输精的环节。第13天上午、下午分别对发情母牛人工授精，各输精1次，每次输2支精液，输精位置为母牛双侧子宫角，输精操作必须轻柔，缓进缓出，防止精液倒流及子宫、生殖道受伤，配种后肌肉注射50 μg促黄体素释放激素A3，如第14天早上发现有供体母牛发情，流粘较清，有相互爬跨等现象，还需要再对母牛输精1次。

采胚技术：在试验第20天，即发情后的第7天，对试验母牛采用单路式冲卵管进行非手术冲卵。先将牛保定好，用2%的普鲁卡因或3～5 mL利多卡因行尾椎硬膜外麻醉。用子宫颈黏液去除器吸除黏液，在助手的协助下，将带钢芯的冲卵管插个阴门，达到子宫颈口。用直肠把握法将冲卵管缓缓插入子宫颈和子宫角，当冲卵管到达子宫角弯曲处时，拔出一小部分钢芯，再将冲卵管往前送，当钢芯再次到达子宫角弯曲处时，再拔出一小部分钢芯，将冲卵管往前送，直到冲卵管到达子宫角前端为止，用20 mL的注射器给冲卵管气囊充气约12～18 mL，需根据子宫角的大小确定充气量，最后拔出钢芯，用冲卵液冲洗出子宫受精卵(即胚胎)，回收冲卵液，收集胚胎。

胚胎鉴定分级法：快速镜检回收的冲胚液并鉴定胚胎，统计胚胎总数、可用胚胎数、一级胚胎数。一级胚：形态完整，外形匀称，呈球形，分裂球细胞大小均匀，结构紧凑，透明度适中，没有或只有少量游离细胞。二级胚：发育稍迟缓，有少量游离细胞(<20%)，细胞团完整，呈球形，细胞之间结合紧密。三级胚胎：发育迟缓1～2 d，卵裂球大小不均匀，透明度变化明显(太暗或太明)，游离细胞较多(20%～50%)，细胞联结不够紧密，胚胎呈球形，有明显的细胞团结构。四级胚胎：发育迟缓2 d以上，细胞团破碎，细胞死亡退化，为不可用胚胎。一、二级胚胎可用于鲜胚移植和冷冻保存，三级胚胎只能用于鲜胚移植，不能用于冷冻保存，一、二、三级胚胎为可用胚胎。

1.6 测定项目与统计方法

依据胚胎鉴定分级法对各组回收的胚胎进行鉴定分级，统计各组总的胚胎数、可用胚数、一级胚数。采用SPSS 17.0统计软件处理试验数据，用LSR法q检验对各组平均数进行差异性显著性检验，并依据下列公式计算可用胚率和一级胚胎率。可用胚率=可用胚胎数÷总胚胎数×100%，一级胚胎率=一级胚胎数÷总胚胎数×100%，采用2个样本百分数差异显著性检验(t法)分别对各组可用胚率和一级胚率作差异性检验。

2 结果与分析

2.1 西门塔尔母牛超数排卵获胚胎情况

据表2，试验母牛获得胚胎最高14枚，最低3枚，平均数(8.02±2.75)枚，都安组产胚最高，头均(8.50±2.58)枚，4组间无显著差异(P>0.05)。数据表明，西门塔尔母牛对外源激素的作用有良好的应答，试验方法适用，试验取得良好的效果。

表2 西门塔尔母牛超数排卵获胚数量 枚

2.2 西门塔尔母牛超数排卵获可用胚和一级胚情况

本次试验母牛头均获可用胚1～9枚，平均(4.64±1.84)枚；一级胚为0～3枚，平均(1.56±0.94)枚；可用胚率20%～77.78%，平均为57.89%；一级胚率0～33.33%，平均19.49%，可用胚、一级胚等结果与国内同行水平比较相当。可用胚数、一级胚数、可用胚比率、一级胚比率组间无显著差异(P>0.05)，但都安组在获得可用胚数、一级胚数及一级胚率上均优于其余三组，分别高出平均值6.47%，16.03%和9.39%。大化组总胚和可用胚数不高，但是可用胚比率是最高的，优质胚胎比例大，比最低组提高了8.07%，。笔者认为，规模化程度较高的牛场在选择优秀母牛方面有较大的优势，优秀母牛获得胚胎的数量和质量要优于普通母牛，另外，饲养管理和日粮营养水平对母牛获得胚胎质量均有影响，以上分析可能是各组超排效果存在差别的原因。

表3 4组西门塔尔母牛超数排卵效果分析

3 讨 论

影响牛超排效果的因素较多，牛的品种、营养水平、超排处理方法、激素种类及冲胚技术的娴熟度等对超排效果均有影响[1-3，6-7]。试验采用GIOB+FSH+PGF2处理广西4组西门塔尔肉牛，超数排卵的效果还是比较好的，比宁财等采用日本进口FSH处理锦江牛获得胚胎数5.8枚和可用胚3.8枚稍高[5]，与薛仰全等采用CUE+MATE孕酮栓+FSH+PGF2α处理奶牛获得头均可用胚4.86枚相当[3]。FSH剂量可以影响胚胎数量和质量，在实践中掌握牛的胎次及年龄，确定合适的FSH剂量方能达到较好的超排效果[2，6，8]。营养和环境因素对超排母牛也有影响[3，10-12]，应尽量规避和降低不良应激因素对牛体的影响。本次4组试验牛用药和处理方法相同，饲养管理相仿，但所处的环境不同，采胚操作不是同一人完成，牛个体对激素应答反应有差异，均可能是超排效果有差别的原因。

4 结 论

(1)试验采用孕酮栓(GIOB)+促卵泡素(FSH)+氯前列烯醇(PGF2)的方法对广西西门塔尔肉牛超数排卵效果良好，获得的总胚胎数、可用胚数及可用胚率与国内同行超排数据相近，试验结果为今后肉牛繁育技术的更广泛开展提供参考。

(2)广西的规模牛场已具备完善的牛超数排卵、胚胎移植的条件，基本掌握牛同期发情、超数排卵及胚胎移植等技术及流程，但在技术细节上还需要加强和提高，主要表现在试验牛的选择和冲胚技术方面。在实际生产中，一些牛场在选择超排试验母牛时，只要认为牛只表面健康、无明显的繁殖性疾病就选定为试验母牛，笔者认为这样欠妥，试验前应当查看牛只配种档案，挑选体格健康、情期受胎率高、繁殖性能优良的母牛作为超数排卵母牛，才能确保繁育技术的高效和稳定。另外，冲胚技术的娴熟度对胚胎回收率和母牛健康有很大影响，生产实践中也应加强和提高。