猪丹毒丝菌CbpB基因的克隆表达及其间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

刘君雯，王 迪，朱艳艳，邢 刚，占松鹤，刘晓露，魏建忠，孙 裴，刘雪兰，李 郁，*

(1.安徽农业大学 动物科技学院，安徽 合肥 230036；2.马鞍山史记动物健康管理有限公司，安徽 马鞍山 238251；3.安徽省动物疫病预防与控制中心，安徽 合肥 230091)

猪丹毒(swine erysipelas)是由猪丹毒丝菌(Erysipelothrixrhusiopathiae，ER)引起的一种急性、热性人畜共患传染病，我国农业农村部将其列为二类动物疫病。临床表现主要为急性败血症、亚急性皮肤疹块、慢性非化脓性关节炎和疣状心内膜炎[1]。该病遍布世界各地，不仅能对猪肉生产的各个阶段产生影响，而且可对密切接触染疫动物及其产品的人员造成感染高风险。

疫苗接种是预防和控制猪丹毒的有力措施。近十多年来，由于许多猪场着重对猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒病、猪瘟、猪伪狂犬病等疫病的免疫防控，却忽略甚或放弃了猪丹毒疫苗的正常使用，引致“老病新发”，经济损失日趋明显。而猪丹毒发病率和病死率的变化取决于猪群免疫状态水平的不同，其中体液免疫起着非常显著的作用。因此，加强ER免疫抗体与感染抗体的监测有助于ER疫苗免疫效果的评估及ER感染的调查与诊断。目前检测ER抗体的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法主要有Dot-PAA-ELISA[2]、基于ER全菌体为包被抗原的间接ELISA方法[3]、基于ER SpaA蛋白为抗原的间接ELISA方法[4]。Dot-PAA-ELISA需要对抗体滴度进行半定量分析，操作复杂；基于ER全菌体为包被抗原的间接ELISA虽然操作过程简单，但存在特异性差、抗原成分复杂的可能。因此，建立一种快速、敏感、操作简便的特异性检测猪丹毒丝菌抗体的方法尤为重要。

ER表面存在的胆碱结合蛋白(choline-binding protein，CBPs)由CbpA、CbpB、CbpC三部分组成。Shi等[5]构建的CBPs缺失突变株免疫小鼠后，可使其完全抵抗ER强毒株的攻击，表明CBPs也是ER致病力的关键因素。研究发现，CbpA蛋白因单碱基缺失引起的移码突变导致蛋白截短，CbpC蛋白被证明无免疫保护作用，而CpbB蛋白被证明是ER的表面保护性蛋白，具有良好的免疫原性，可诱导机体(小鼠、猪) IgG抗体水平升高，并对小鼠的免疫保护率达80.00%，从而免受ER强毒株的攻击[6-7]。CbpB基因大小为1 855 bp，它所编码的CpbB蛋白由606个氨基酸组成，主要包括N端的一段信号序列(the signal sequence)和C端的胆碱结合区域(choline-binding domain)。本实验利用CbpB蛋白作为包被抗原建立检测ER抗体的间接ELISA方法，旨在为猪群的ER免疫监测和流行病学调查提供可靠的技术手段。

1 材料与方法

1.1 菌株、载体和血清

ER血清型1a型(代号AEr21)，E.coliDH5α、E.coilBL21菌株，载体pGEx-6P-1，ER阴性血清和阳性血清[8]，猪链球菌(SS)、大肠埃希菌(E.coli)、副猪嗜血杆菌(HPS)、传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)阳性血清，均由安徽农业大学动物传染病实验室保存提供。用于临床检测应用的猪血清样品(进行和未进行ER疫苗免疫)均采自安徽地区部分猪场。

1.2 主要试剂和培养基

限制性内切酶XhoⅠ和BamHⅠ、T4 DNA ligase、10×loading buffer、DNA Marker 2000、DNA Marker 10000购自TaKaRa有限公司。2×Taqplus PCR Master Mix、DNA胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒购自天根生物有限公司。谷胱甘肽GST琼脂糖凝胶FF购自北京瑞达恒辉科技发展有限公司。胎牛血清、Tween-20、牛血清白蛋白(BSA)、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、氨苄青霉素(Amp)、未预染和预染标准蛋白Marker、3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)显色液、H2SO4终止液、β-巯基乙醇和二氨基联苯胺(DAB)购自上海生工生物工程技术服务有限公司。十二烷基硫酸钠(SDS)、过硫酸铵(APS)、三羟甲基氨基甲烷(Tris 碱)购自天根生化科技有限公司。脱脂奶粉、羊抗猪IgG(IgG-HRP)购自 SIGMA 公司。酶标板购自美国Corning公司、商品化ER抗体检测试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司(ML096852)。全菌体包被间接ELISA、SpaA蛋白包被间接ELISA[4]均由安徽农业大学动物传染病实验室提供。含0.6%酵母浸膏胰酪胨大豆肉汤(TSB-YE)、含0.6%酵母浸膏胰酪胨大豆琼脂(TSA-YE)、LB肉汤购自绍兴天恒生物科技有限公司。商品化猪丹毒灭活疫苗购自成都天邦生物制品有限公司。

1.3 目的蛋白的表达与鉴定

1.3.1 引物的合成

根据GenBank中已登录的ER的CbpB基因(登录号：AP012027)，应用Primer Premier5.0设计一对特异性引物，预期扩增片段为1 398 bp，上、下游引物中各引入了BamHⅠ(GGATCC)、XhoⅠ(CTCGAG)限制性内切酶的酶切位点，引物由金斯瑞生物工程有限公司合成。引物序列如下：上游引物：5′-CGCGGATCCATGCGATTGAGACGCTTACAGAGG-3 ′；下游引物：5′-CCGCTCGAGGCCATCATTCCTGACGGT-3 ′。

1.3.2 目的片段的扩增及重组质粒的构建

采用煮沸法提取AEr21基因组DNA作为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系：PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，灭菌双蒸水12.5 μL，DNA模板5 μL。反应条件：预变性95 ℃ 5 min；变性95 ℃ 5 min，退火65 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 2 min，35个循环；终延伸72 ℃ 10 min。反应结束后，将PCR产物进行1.00%琼脂糖凝胶电泳，再用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对目的片段进行回收。用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切 pGEX-6P-1和CbpB基因，进行琼脂糖凝胶电泳后回收，用T4 DNA连接酶将两者于16 ℃连接过夜，并将连接产物转化入感受态细胞E.coilDH5α，涂布于Amp浓度为100 μg·mL-1的LB平板上。PCR鉴定阳性的质粒进一步作序列测定。测序由金斯瑞生物技术有限公司进行。

1.3.3 重组CbpB蛋白的表达及纯化

将阳性重组质粒pGEX-6P-1-CbpB转化至E.coilBL21感受态细胞，挑取单菌落接种于LB固体培养基(含0.10% Amp)中，37 ℃培养12 h。挑取单个菌落接种至5 mL LB液体培养基(含0.10% Amp)中，37 ℃、150 r·min-1振荡培养至菌液D600为0.4，再吸取1 mL菌液转接于100 mL的LB液体培养基(含0.10% Amp)中，37 ℃、150 r·min-1振荡培养6 h，加入IPTG后继续在30 ℃、180 r·min-1诱导表达6 h，离心收集菌体。菌体经超声破碎后，将离心收集的上清与谷胱甘肽GST琼脂糖凝胶FF在室温条件下振荡1 h，再用20 mmol·L-1谷胱甘肽溶液洗脱得到纯化目的蛋白[9]。用核酸蛋白仪测定纯化后的重组蛋白含量，并进行SDS-PAGE分析。

1.3.4 重组CbpB蛋白的Western-blot分析

将纯化后的重组CbpB蛋白转印到硝酸纤维素膜上，于含5%脱脂奶粉的封闭液中4 ℃封闭过夜。以ER阳性血清(1∶100稀释)为一抗，37 ℃孵育1 h，洗膜后用1∶2 000稀释的羊抗猪IgG-HRP为酶标二抗，37 ℃孵育1 h，最后置于DAB缓冲液中显色。

1.4 CbpB蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立

1.4.1 间接ELISA主要操作步骤

将纯化重组CbpB蛋白适当稀释后加入酶标板中，每孔100 μL，4 ℃包被过夜，弃去包被液，用PBST(含有0.05% Tween-20的PBS)洗涤3次，每次振荡3 min；加入封闭液(1%BSA)，每孔200 μL，37 ℃封闭1 h，PBST洗涤3次；加入1:100稀释的血清，每孔100 μL，并设置阴性对照，37 ℃孵育1 h，PBST洗涤3次；加入1∶1 000稀释的羊抗猪IgG-HRP，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h，PBST洗涤3次；加入TMB显色液，每孔100 μL，37 ℃避光显色10 min；加入H2SO4终止反应，每孔100 μL，测定D450值。每个稀释度做3个重复，取其平均值，计算各条件下P/N值。选择阳性血清D450值接近1.0，阴性血清D450≤0.2且P/N值最大孔所对应的优化条件为最佳[10]。

1.4.2 最适抗原包被浓度和血清稀释度的确定

采用方阵滴定法确定最适抗原包被浓度和血清稀释度。将CbpB蛋白用pH 9.6的碳酸盐缓冲液分别稀释至4.0、2.0、1.0、0.5 μg·mL-1，ER阴性血清和阳性血清用PBST缓冲液均按1∶50、1∶100、1∶200、1∶400倍稀释后进行ELISA方阵试验。每个稀释度3个重复，测定D450值，计算P/N值。

1.4.3 最适抗原包被条件的确定

以最适的抗原浓度包被酶标板，分别在4 ℃过夜12 h、37 ℃ 1 h+4 ℃过夜12 h、37 ℃ 2 h+4 ℃过夜12 h、37 ℃ 1 h、37 ℃ 2 h包被后进行间接 ELISA测定。重复3次操作，读取D450值，计算P/N值。

1.4.4 最适封闭液种类的确定

分别以1%明胶、2%脱脂奶粉、1% BSA、2% BSA、5%胎牛血清为封闭液，37 ℃封闭2 h后进行间接ELISA抗体检测。重复3次操作，测定D450值取平均值，计算 P/N值。

1.4.5 最适血清作用时间的确定

加入血清后，于37 ℃分别作用 30、60、90 min后进行间接 ELISA测定。重复3次操作，读取D450值并取平均值，计算P/N值。

1.4.6 最适酶标二抗浓度及作用时间的确定

按照上述确定好的最适条件依次进行包被、封闭、加入ER阴性血清和阳性血清，将羊抗猪IgG-HRP分别做1∶800、1∶1 000、1∶2 000、1∶3 000稀释，于37 ℃孵育30、45、60、75 min，按照间接 ELISA方法测定。重复3次操作，测定D450值取平均值，计算P/N值。

1.4.7 最适显色时间的确定

按照上述确定好的最适条件进行间接ELISA试验，加入TMB后分别于37 ℃避光显色5、10、15 min，重复3次操作，读取D450值取平均值，计算P/N值。

1.4.8 临界值的确定

按照上述以最适反应条件建立的间接ELISA方法，对30份已知ER抗体阴性血清进行检测，测定其D450值，计算平均值x和标准差s，以D450

1.4.9 特异性试验

采用建立的间接ELISA方法检测HPS、SS、APP、E.coli、PRV、CSFV、PCV2、PRRSV及ER阳性血清各2份，同时设立ER阴、阳性血清作对照，评估该方法的特异性。

1.4.10 敏感性试验

将ER阳性血清按1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600、1∶51 200、1∶102 400进行倍比稀释，采用建立的间接ELISA方法与商品化ELISA检测试剂盒进行ER抗体滴度的检测比较，评估该方法的敏感性。

1.4.11 重复性试验

分别用同一批次和3个不同批次ER重组表达纯化的CbpB蛋白进行包被，用建立的间接ELISA方法分别对4份ER抗体水平不同的血清样品进行批内及批间重复性试验，每份血清样品重复3次检测。计算4份血清样品同一批内和不同批次D450值的变异系数(CV=SD/x×100%)，评估该方法的重复性[12]。

1.4.12 比对试验

利用建立的间接ELISA方法(代号为CbpB-ELISA)检测60份进行ER疫苗免疫的猪血清样品，并与全菌体包被间接ELISA(代号为全菌体-ELISA)、SpaA蛋白包被间接ELISA(代号为SpaA-ELISA)、商品化抗体检测ELISA试剂盒及Western-blot(抗原为ER重组CbpB蛋白)作平行比较，计算符合率。符合率=(阳性结果相同样本数+阴性结果相同样本数)/总样本数。

1.4.13 临床猪血清检测

利用建立的间接ELISA方法对安徽10个地市未经ER疫苗接种的200份猪血清样品进行感染抗体检测。采用SPSS 22.0 软件进行数据处理、卡方检验。P<0.01表示差异极显著；P<0.05表示差异显著；P>0.05表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 CbpB基因的扩增

利用特异性引物对AEr21的CbpB基因进行PCR扩增，扩增出大小约为1 398 bp的基因片段，其长度与预期大小一致(图1)。

2.2 重组表达质粒pGEX-6P-1-CbpB的鉴定

将阳性重组质粒双酶切后可见相对分子质量约1 398 bp的目的条带和4 984 bp的质粒条带(图2)，片段大小和预期一致。

2.3 重组CbpB蛋白的诱导表达及纯化

M，DNA marker；1-2，BamHⅠ/XhoⅠ双酶切重组质粒pGEX-6P-1-CbpB。M，DNA marker; 1-2，Digested pGEX-6P-1-CbpB.图2 重组质粒pGEX-6P-1-CbpB的双酶切鉴定Fig.2 Restriction enzyme digestion identification of recombinant plasmid pGEX-6P-1-CbpB

用终浓度为0.6 mmol·L-1的IPTG在37 ℃诱导6 h，蛋白表达量最大，在73 ku处出现目的蛋白条带(图3)，与预期相同，纯化后的重组蛋白含量为0.46 mg·mL-1(图4)。

M，蛋白marker；1-2，未纯化的CbpB蛋白。M，Protein marker; 1-2，Unpurified CbpB protein.图3 CbpB重组蛋白的诱导表达Fig.3 induced expression of recombinant CbpB protein

M，蛋白marker；1-2，纯化后的CbpB蛋白。M，Protein marker; 1-2，Purified CbpB protein.图4 CbpB重组蛋白的纯化分析Fig.4 Induced expression of recombinant CbpB protein

2.4 重组CbpB蛋白的Western-blot分析

对纯化后的CbpB重组蛋白进行Western-blot 分析，在73 ku处出现预期的特异性条带，而非诱导后的裂解产物则无特异性条带，表明表达产物能够与ER阳性血清发生特异性结合，具有良好的反应原性(图5)。

2.5 CbpB蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立

2.5.1 间接ELISA反应条件的优化

通过最适抗原包被浓度、温度和时间，最适血清稀释度和作用时间，最适封闭液和封闭时间，最适酶标二抗浓度和作用时间，以及最适显色时间等一系列试验，优化了间接ELISA的反应条件，具体如下：包被抗原浓度为1.0 μg·mL-1，4 ℃过夜；5%脱脂奶粉于37 ℃封闭2 h；血清稀释度为1∶100，37 ℃孵育60 min；酶标二抗稀释度为1∶1 000，37 ℃作用45 min；显色时间为37 ℃作用10 min。

M，蛋白marker；1，诱导后的裂解产物；2，非诱导后的裂解产物。M，Protein marker; 1，Induced pyrolysis products; 2，Non-induced pyrolysis products.图5 CbpB重组蛋白的Western-blot鉴定Fig.5 Western-blot identification of CbpB recombinant protein

2.5.2 临界值的确定

2.5.3 特异性试验

利用建立的CbpB-ELISA检测ER阳性血清的结果为阳性，而对HPS、SS、APP、E.coli、PRV、CSFV、PCV2、PRRSV阳性血清，结果均为阴性(表1)，表明该方法具有良好的特异性。

2.5.4 敏感性试验

建立的CbpB-ELISA与商品化ELISA试剂盒能检测到的最高阳性血清稀释度均为1∶12 800，表明两种方法均具有良好的敏感性。

2.5.5 重复性试验

建立的CbpB-ELISA批内重复性试验的变异系数为4.08%～5.90%，批间重复性试验的变异系数为3.59%～7.92%，均小于10%(表2)，表明该方法具有良好的重复性。

2.5.6 比对试验

利用建立的CbpB-ELISA检测60份经猪丹毒灭活疫苗免疫的猪血清样品，其中52份为ER阳性血清，免疫抗体阳性率为86.67%[8]，平行比对，与全菌体-ELISA、SpaA-ELISA、商品化抗体检测ELISA试剂盒及Western-blot的总符合率分别为91.67%、93.33%、86.67%和90.00%，其中阳性符合率分别为92.45%、94.55%、88.89%、90.91%，阴性符合率分别为85.71%、80.00%、66.67%、80.00%(表3)，表明具有较高的一致性。

表1 特异性试验结果

表2 重复性试验结果

表3 CbpB-ELISA与全菌体-ELISA、SpaA-ELISA、商品化ELISA试剂盒、Western-blot鉴定结果比较

2.5.7 临床猪血清检测

利用建立的CbpB-ELISA检测200份未经ER疫苗免疫的猪血清样品，其中61份为ER阳性血清，感染抗体阳性率为30.5%。样品来源的安徽10个地市ER感染率由高到低依次是：合肥55%、阜阳40%、淮南40%、蚌埠35%、六安35%、安庆30%、亳州20%、池州20%、芜湖20%、马鞍山10%。卡方检验结果显示：合肥与阜阳、淮南、蚌埠、六安、安庆、亳州、池州、芜湖、马鞍山9个地市之间ER感染率差异显著(P<0.05)；安庆与蚌埠、六安2个地市之间ER感染率差异不显著(P>0.05)，而与合肥、阜阳、淮南、亳州、池州、芜湖、马鞍山7个地市之间ER感染率差异显著(P<0.05)；亳州、池州、芜湖3个地市与合肥、阜阳、淮南、蚌埠、六安、安庆、马鞍山7个地市之间ER感染率差异显著(P<0.05)；马鞍山与合肥、阜阳、淮南、蚌埠、六安、安庆、亳州、池州、芜湖9个地市之间ER感染率差异显著(P<0.05)。表明安徽10个地市均存在不同程度的ER感染，其中合肥感染率最高(表4)。

表4 安徽10个地市ER感染抗体的检测结果

3 讨论

由猪丹毒丝菌(ER)引起的猪丹毒呈全球性分布，不仅为一种人畜共患病，更是世界各国经济上的一种重要疾病。20世纪80年代和90年代初，猪丹毒与猪瘟、猪肺疫并称为我国养猪业的三大传染病。随着养猪业规模化的发展、饲养环境和管理模式的改善、疫苗和抗生素的使用，猪丹毒似乎逐渐淡出了人们的视野，致使很多养猪场忽略了对该病的防控，造成了较大的经济损失。疫苗接种是预防猪丹毒发生的广泛而有效的方法。当前使用的疫苗是以1型或2型的ER为基础而制备的，既有用于肌肉注射的灭活疫苗(多为血清2型)，又有通过饮水途径的减毒活疫苗(多为血清1a型)。迄今为止ER共有26个血清型(1a、1b、2～24型和N型)，猪丹毒自然病例主要是由血清1a、1b或2型引起，我国猪群中流行的血清型主要为1a型(80%～90%)，其次是2型[13-14]。不同ER菌株的毒力存在明显的差异，这是由一些毒力因子调控所致。ER最重要的毒力因子是神经氨酸酶、荚膜多糖和表面蛋白，其中表面蛋白如SpaA、CbpB等与ER的致病力密切相关[5]。CbpB蛋白C端的胆碱结合区域能够与绝大多数革兰氏阳性细菌的细胞表面结合，在其感染过程中起着很重要的作用，而CbpB蛋白主要免疫保护功能的核心片段多位于N端[6-7]。作为ER荚膜修饰蛋白，CbpB不仅介导增强ER对宿主细胞的黏附作用、减弱吞噬细胞对病原菌的吞噬作用，而且经CbpB蛋白免疫的小鼠血清则具有促进体外巨噬细胞的吞噬作用[5，15]。

目前，国内外均未见基于CbpB蛋白建立检测ER抗体的间接ELISA方法的相关报道。本实验克隆表达了ER(血清1a型)的表面蛋白CbpB，通过亲和层析法纯化蛋白，通过Western-blot鉴定重组表达蛋白具有良好的反应原性。利用重组表达纯化的CbpB蛋白作为包被抗原，通过对抗原包被浓度、血清稀释度、酶标二抗稀释度及反应时间等一系列条件的优化，建立了检测ER抗体的间接ELISA方法(CbpB-ELISA)。该方法与其他诸如HPS、SS、APP、E.coli、PRV、CSFV、PCV2、PRRSV阳性血清均不出现特异性结合反应，仅可检测ER抗体，当ER阳性血清稀释至1∶12 800时仍可检出，批内及批间变异系数均小于10.00%，与全菌体-ELISA、SpaA-ELISA、商品化ELISA试剂盒和Western-blot的总符合率分别为91.67%、93.33%、86.67%和90.00%，其中阳性符合率分别为92.45%、94.55%、88.89%、90.91%，阴性符合率分别为85.71%、80.00%、66.67%、80.00%，表明本实验所建立的CbpB-ELISA具有良好的特异性、敏感性、重复性以及可靠性。

在成功建立CbpB-ELISA用于检测ER抗体的基础上，进一步利用该方法对来自安徽10个地市的临床样品进行检测。在200份未经ER疫苗接种的猪血清样品中，61份为阳性，检出率为30.50%，表明安徽各地市均有不同程度的ER感染现象，不同地市之间的感染情况差异显著，其中合肥的感染率最高，其次是阜阳和淮南。Holt等[16]和Shimoji等[17]分别对老挝和日本未经ER疫苗免疫的家猪和野猪进行血清学调查，结果显示，老挝和日本ER感染抗体阳性检出率分别为45.20%(293/647)和95.60%(1312/1372)。2009年周绪斌等[18]对我国33个猪场共775份血清样品进行ER感染抗体检测，阳性率为14.19% (110/775) 。虽然我国猪群中ER感染的整体比例不甚高，但本实验的结果显示，安徽猪群中ER感染率高于全国平均水平，故应引起高度重视，加强对猪丹毒的预防和控制。

4 结论

本实验以重组表达的CbpB蛋白作为包被抗原，成功建立了具有良好的特异性、敏感性、重复性和可靠性的检测ER抗体的间接ELISA方法。应用建立的方法对进行和未进行ER疫苗免疫的猪血清样品进行抗体检测，确证了该方法可用于临床ER的免疫监测和流行病学调查。