利用物种特异性PCR技术快速鉴定南瓜实蝇

黄 振，侯有明 ，郭琼霞 ，陈韶萍,

（1. 福建农林大学植物保护学院，福建 福州 350002；2. 福州长乐机场海关，福建 福州 350209；3. 福州海关技术中心，福建 福州 350001）

0 引言

【研究意义】南瓜实蝇Bactrocera tau（Walker），属双翅目Diptera、实蝇科Tephritidae、果实蝇属Bactrocera[1]，是我国进境植物检疫性害虫。卵、幼虫、蛹能随寄主如果蔬、土壤、包装物等可进行远距离传播。南瓜实蝇食性杂、寄主广，达16个科80余种[2]，主要危害南瓜、角瓜、丝瓜、黄瓜、葫芦、苦瓜、桑椹、西瓜、菠萝蜜、杨桃、芒果、番石榴、番茄、扁蒲、菜豆等瓜果植物，对葫芦科植物危害尤为严重[3]。Walker1849年首次在中国报道[4]，目前主要报道分布在越南、缅甸、泰国、老挝、日本、柬埔寨、马来西亚、菲律宾、新加坡、不丹、斯里兰卡、印度、印度尼西亚等地[5−6]。国际果蔬贸易给南瓜实蝇的传入传播带来了极大的潜在风险[7]，日常分类鉴定工作通常以成虫外部形态特征作为分类鉴定依据，而日常检疫中经常截获幼虫、卵或蛹，甚至翅、足等残体，无法快速、准确鉴定，通常是在实验室内饲养为成虫后进行鉴定，耗时较长，严重影响果蔬进出口贸易的通关速度。因此，建立快速、特异、有效的PCR技术，对快速鉴定南瓜实蝇具有重要的现实意义。【前人研究进展】采用分子生物学的方法开展昆虫种类鉴定，可以解决通过传统形态特征不能进行实蝇种类鉴定的问题。越来越多的分子鉴定技术被运用于昆虫的鉴定[8]。Mun等[9]应用限制性内切酶Apa I、Nhe I和Sac I，将南瓜实蝇、桔小实蝇和地中海实蝇等4种实蝇区分开来。吴佳教等[10]用PCR-RFLP技术对我国口岸截获频率较高的9种检疫性实蝇开展了研究，用限制性内切酶MSE1和DRAI对PCR扩增产物进行酶切，用得到的酶切位点将供试的9种实蝇区分开来。张亮等[11]通过 RAPD 技术构建了南瓜实蝇、黑膝实蝇B. scutellaris等6种实蝇的指纹图谱的分种鉴定。林丽莉等[12]应用RFLP技术，对我国部分地区发生分布的蜜柑大实蝇B. tsuneonis（Miyake）和橘大实蝇B. minax（Enderlein）开展鉴别研究。Chua等[13]采用RFLP技术成功地区分了洋桃实蝇和木瓜实蝇，进而使桔小实蝇复合种的有效识别得以实现。Kakouli等[14]用扩增片段长度多态性技术 AFLP进行了实蝇种类的检测鉴定。然而，上述对实蝇的检测鉴定技术各有优缺点，如 RFLP和RAPD技术具有需求DNA的量较少、基因的多态性丰富、对基因组的覆盖范围比较广等优点；但RFLP技术由于操作繁琐，需通过检测内切酶识别位点上的变异，来进行昆虫种间亲缘关系和昆虫种属特异性鉴定，多态性检出率低，而RAPD 技术的稳定性较差，对试验环境因子变化较为敏感，扩增的产物可重复性、稳定性较低等，限制了RFLP和RAPD技术的广泛应用[15]。虽然AFLP技术可以较好地弥补上述两种技术方法的不足，但AFLP技术对检测样本DNA的质量要求较高，且所需设备的费用较为昂贵。因此，上述的检测方法难以满足口岸进出境果蔬贸易快速通关、准确鉴定及低成本的检疫需求。因为mtDNA COⅠ基因相对保守，排列的顺序比较稳定紧密，容易被通用引物扩增，又有足够的特异性能将不同物种区分开，所以mtDNA COⅠ基因作为标记基因，为生物分类学提供了信息化的分类标准和有效的分类手段，成为目前昆虫分类鉴定及昆虫分子进化系统研究应用较多的基因之一，并被应用于实蝇近缘种的系统发育研究[16−18]。【本研究切入点】基于RAPD、AFLP、RFLP等技术在实际应用中表现的不足[19]，本试验在前人利用COI标记鉴定技术的基础上，利用mt DNA COI基因序列，筛选并设计种特异引物[20]，采用SS-PCR方法快速鉴定南瓜实蝇。【拟解决的关键问题】应用种特异性引物快速鉴定南瓜实蝇的方法，实现对口岸进境水果携带并截获的疑似南瓜实蝇的卵、幼虫、蛹、成虫及成虫残体的快速鉴定。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

供试虫样：南瓜实蝇B. tau（Walker）、洋桃实蝇B. carambolae Drew & Hancock、瓜实蝇B. cucurbitae（Coquillett）、辣 椒 实 蝇B. latifrons（Hendel）、腿端黑实蝇B. atrifemur Drew & Hancock、番石榴果实蝇 B. correcta（Bezzi）、二 颜 带 实 蝇 B. cilifera（Hendel）、桔小实蝇B. dorsalis（Hendel）、锈红果实蝇B. rubigina（Wang & Zhao）、瘤胫实蝇B. tuberculata（Bezzi）、具条实蝇B. scutellata（Hendel）、何氏华实蝇B. hochii（Zia）、近黑颜实蝇B. parater（Zhao &Lin）、黑颜实蝇B. diaphora Coquillett、黑膝实蝇B.scutellaris（Bezzi）、滇寡鬃实蝇B. modica（Hardy）、瑞丽果实蝇B. ruiliensis Wang, Long et Zhang, sp. nov.、五指山实蝇B. wuzhishana Lin et Yang, sp. nov.、枣实蝇Carpomya vesuviana Costa、瓜棍腹实蝇Dacus longicornis Wiedemann等20种实蝇，其中除Bactrocera属18种外，另有 Carpomya、Dacus2个属的种类各1种。虫样来自口岸进境果蔬检疫截获、中国边境监测、调查和诱捕的检疫性实蝇种类。用于分子生物学鉴定试验的实蝇标本，放置于4 ℃冰箱保存。

1.2 DNA提取和质量检测

将20种实蝇虫样放置于2 mL的离心管中，加入适量液氮充分研磨，根据用OMEGA E.Z.N.A.TMInsect DNA Kit试剂盒的操作方法，对虫样进行基因组DNA的提取，并放置于−20℃冰箱保存备用。

DNA质量检测采用上游引物LCO1490（碱基序列为：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3′）和下游引物HCO2198（碱基序列为：5′-TAAACTTC AGGGTGACCAAAAAATCA-3′）的1对通用引物对20种实蝇虫样提取的基因组DNA进行质量检测，在定量梯度PCR仪上进行PCR反应，电泳，凝胶成像，拍摄记录质量检测结果。

1.3 引物设计

通过数据库（NCBI）查找已公布的南瓜实蝇的登录序列，分析比较并选定登录号为JN542420的线粒体mt DNA COⅠ基因序列，利用数据库（NCBI）中提供的BLAST程序检查同源序列，最终选定8种实蝇（表1）。

表 1 设计南瓜实蝇特异性引物所用实蝇种类及登录号Table 1 Species and accession numbers of fruit flies used for designing B. tau-specific primers

应用数据库下载FASTA格式，对表1中的8种实蝇序列进行序列比对，再根据SNP位点，利用Primer-Premier 5.0软件进行人工设计引物，采用Oligo 6.44对设置的引物进行评定，最后应用数据库（NCBI）中 的Primer-BLAST（BLAST：Basic Local Alignment Search Tool）DNA数据库进行相似性比较分 析，检查同源序列。

1.4 引物种特异性测试

测试南瓜实蝇引物的种特异性时，选取南瓜实蝇为阳性对照，其余的20种实蝇虫样为阴性对照，检测验证设计引物种特异性测试的反应体系和条件，电泳检测，凝胶成像，查看有否扩增出预期大小 的目标片段，拍摄并记录结果。

1.5 引物灵敏度测试

将提取南瓜实蝇的基因组DNA模板，按照10−1、10−2、10−3倍3种不同浓度稀释，测试提取的南瓜实蝇DNA的稀释浓度后的灵敏度。用设计的种特异性引物NF404和NR610进行PCR扩增，对DNA模板进行最低检出阈值的测定，验证本检测方法的灵 敏度。

1.6 SS-PCR方法的应用与验证

将福州长乐机场进境旅客携带果蔬中截获的南瓜实蝇并饲养到成虫，经过专家鉴定复核，收集幼虫、蛹、成虫、足、翅等17个虫样，按照本研究的SS-PCR方法，将提取的基因组DNA为模板，应用种特异性引物NF404和NR610进行PCR扩增，来验证 该方法的稳定性与准确性。

2 结果与分析

2.1 DNA 质量检测结果

采用1对LCO1490和HCO2198通用引物，对提取的20种实蝇虫样的基因组DNA模板进行PCR扩增，结果显示所有的实蝇虫样的DNA均能扩增出一条单一整齐且清晰透明的，长度约700 bp的目标条带（图1）。

图 1 利用LCO1490和HC02198 一对通用型引物对提取的实蝇DNA模板进行质量检测的结果Fig. 1 Utilization of universal primers, LCO1490 and HC02198,for testing extracted DNA templates from fruit flies

2.2 特异性引物选择

应用Bioedit对已下载的JN542420.1、HM561566.1、JN542417.1、AY530891.1、AF423105.1、JX855917.1、KF998674.1、KF318598.1等8种序列进行ClustalW多重比对，通过筛选最终选择的种特异性引物NF′404和NR′610（图2）。

图 2 8种果实蝇的ClustalW多重比对的部分结果（种特异性引物NF’404和NR’610序列位置用横线划出）Fig. 2 Partial result of ClustalW multiple comparisons on 8 fruit flies

NF′404：5′-TGCCTCGACGATATTCTGACT-3′；

NR′610：5′-AACTGTGTTCAGCAGGTGGT-3′。

将NF′404和NR′610利用NCBI数据库提供的Primer-BLAST程序检查同源序列，最终将正向引物NF′404第6个碱基C转换成T，第7个碱基G转换成A，第8、19个碱基A转换成G，确定出引物NF404和NR610。

筛选出NF404和NR610种特异性引物，由上海英潍捷基贸易有限公司合成。特异性引物NF404和NR610的序列分别为：

NF404：5′-TGCCTTAGCGATATTCTGGCT-3′；

NR610：5′-AACTGTGTTCAGCAGGTGGT-3′。

2.3 引物种特异性

选用筛选获得的种特异性引物NF404和NR610进行扩增，结果表明：仅南瓜实蝇扩增出一条清晰透明且单一的约207 bp的条带，其他20种实蝇种类样本均未显现目标条带（图3）。表明该试验设计的NF404和NR610种特异性引物具有较强的特异性和稳定性。

上海英潍捷基贸易有限公司对本试验将所得到的PCR产物进行测序，将序列提交NCBI数据库进行相似性分析（BLAST），表明该段序列与数据库中 的南瓜实蝇序列完全一致。

2.4 引物的灵敏度

应用核酸蛋白分析仪对提取的南瓜实蝇DNA模板的质量浓度进行测试，质量浓度为56.95 ng·μL−1。取3种不同浓度的DNA模版测定最低检出阈值，结果表明：随着模版质量浓度的降低，扩增出的条带逐渐变淡，在质量浓度稀释100倍后，仍可见较为明 显条带（图4），说明本试验方法灵敏度较高。

2.5 应用与验证

采用SS-PCR快速鉴定技术对截获的南瓜实蝇标

图 3 引物NF404和NR610的种特异性验证Fig. 3 Verification on species-specificity of primers, NF404 and NR610

图 4 引物NF404和NR610的灵敏度验证Fig. 4 Verification on sensitivity of primers, NF404 and NR610

本进行检测验证，取经复核鉴定的幼虫、蛹、成虫及成虫的足、翅或部分残体等17个样品经过检验，均检测有目标条带（图5），说明分子生物学鉴定结果与形态学鉴定结果一致，即基于mt DNA COⅠ基因建立的种特异性COⅠ引物具有很强的特异性，SS-PCR快速鉴定南瓜实蝇的方法可以应用于实际鉴定。

图 5 SS-PCR快速鉴定南瓜实蝇的应用与验证Fig. 5 Application and verification of SS-PCR for rapid identification of B. tau

3 讨论

3.1 引物的特异性是快速准确鉴定的决定性因素

被选作分子标记的基因很多，但是COI（cytochrome oxidase I或coxI）基因被选为DNA条形码的靶标基因，相对保守，种间变异大，容易被通用引物扩增，同时又有足够的变异能够将近缘种、近似种等分开。本试验选用mt DNA COI作为标记基因，在基因库中筛选查找南瓜实蝇已公布序列进行比对分析，设计引物NF404和NR610，用南瓜实蝇作为阳性对照，用其形态相近的3个果实蝇属4个亚属19种实蝇作为阴性对照，目标种能特异性并稳定地扩增出长度207 bp清晰且单一的目标条带，其他实蝇种类均无条带出现，表明设计引物的种特异性强，能够鉴定南瓜实蝇。

3.2 SS-PCR检测鉴定方法的实用性

采用SS-PCR检测鉴定方法，不但可快速准确鉴定特异种类南瓜实蝇，而且可检测到的DNA模板质量浓度的最低检出阈值为5.695×10−3ng·μL−1。在口岸进境的多批果蔬的检疫检测时，对发现的不同虫态目标实蝇（饲养到成虫及经过专家形态鉴定复核），采用SS-PCR检测鉴定方法，可在8 h之内快速准确鉴定特异种类南瓜实蝇。同时，本试验建立种特异性引物PCR方法检测南瓜实蝇的不同虫态用时短、DNA用量少、灵敏度高、仪器设备简单、鉴定准确率高，能够满足口岸检验检疫高通量快速通关和快速准确的要求，而且本研究建立的方法对南瓜实蝇的卵或虫体部分残体均可检测，不受实验材料存活状态的影响，检测灵敏度高。因此，种特异引物 PCR方法在昆虫的快速鉴定和近缘种区分上有着 广泛的应用前景。

3.3 对线粒体基因组的研究有待于进一步加强

目前，线粒体基因组在实蝇科害虫中的应用较少，仅有3属 14种，在已公开发表的大多文献中只描述了新测定物种的线粒体基因组序列及其特点。对于利用线粒体基因组在实蝇科害虫中进行物种鉴定、种群溯源、分子进化等方面的研究尚未见报道。随着测序技术的发展，获得具有重要经济意义的实蝇种类的线粒体基因组序列研究显得极为迫切，所以对实蝇科昆虫线粒体基因组的研究和应用需要进一步加强。