湖南汨罗一例类NADC30-like和HP-PRRSV毒株混合感染致猪繁殖与呼吸综合征的诊断

欧阳艳，马 涛

（1.湖北三峡职业技术学院农学院，湖北 宜昌 443000；2.湖北省宜昌市动物疫病预防控制中心，湖北 宜昌 443000）

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）以妊娠母猪发生明显的繁殖障碍以及仔猪出现严重的呼吸系统疾病和生长迟缓为主要特征，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种严重危害全球养猪业的病毒性传染病。2006年由高致病性PRRSV（HP-PRRSV）引发的猪“高热病”给我国养猪业造成了沉重的打击。之后，2009年、2011年和2015年PRRS在我国都出现不同程度的暴发。此外，2015年来自美国的NADC30-like毒株在我国不同省份引发母猪严重的流产或早产[1]。笔者根据送检病死仔猪的临床症状、病理变化及实验室检测结果最终确诊为猪繁殖与呼吸综合征类NADC30-like毒株和HP-PRRSV毒株混合感染，现将诊断过程报道如下。

1 发病情况

湖南省汨罗县一存栏400头的保育猪场，2018年7月保育猪（40日龄）开始发病，死亡率高达20%。主要临床症状为厌食、发烧、咳嗽和皮肤发绀等。发病后该猪场用氟苯尼考、金霉素和土霉素等药物拌料进行治疗，未见好转。

图1 发病猪及死亡猪临床症状

2 剖检变化

病理剖检显示，病死猪肺部发生大面积肉变，萎缩塌陷，失去弹性；体表淋巴结肿大，出血严重；肾脏表面有大量针尖大小出血点，切面颜色发黄，皮质增厚，肾乳头有少量出血点；脾脏肿大，边缘有梗死。

图2 病死猪脏器剖检变化图

3 实验室检查

3.1 细菌的分离培养

在无菌操作台上用接种环分别对送检猪肺脏、血液进行挑菌培养，接种于TSA培养基上，置于恒温培养箱（37℃）过夜培养，结果发现未形成菌落。

3.2 病毒的RT-PCR检测

3.2.1 RNA的提取。采集病死猪的肺脏，适量取样，匀浆器研磨10 min后收集匀浆，12000 r/min离心10 min，取上清液200 μL放入DEPC处理过的1.5 mL EP管中，然后每管加入1 mL Trizol裂解细胞，轻柔吹打，反复数次直至均匀。室温放置5 min，加入200 μL氯仿，盖紧盖子在震摇器上涡旋震摇15 sec，充分混匀后冰浴10 min，使混合液分层；然后4℃ 12000 rpm离心 5 min，小心转移 80%的上层液体（约 500～600 μL）到一个新的EP管中，加入与上清液等体积的异丙醇，混匀后室温放置10 min，接着4℃ 12000 rpm离心10 min沉淀核酸；弃掉上清，沉淀用大于1倍Trizol体积的75%的乙醇洗涤，4℃ 7500 rpm离心5 min后小心将上清吸干，沉淀于室温晾干 （5～10 min）后用DEPC处理过的灭菌水溶解，提取的RNA可小量分装于-80℃低温保存。

3.2.2 两步法RT-PCR。第一步为cDNA的合成。

表1 RT反应体系

上述体系与第一步反应体系混匀，反应条件为：42℃ 30 min，99℃ 5 min，5℃ 5 min。 合成好的cDNA立即用于第二步PCR反应。

第二步：特异性DNA片段的合成。

表2 PCR反应体系

得到的PCR产物经过琼脂糖电泳分离后，用凝胶成像系统拍照记录。病料中检测出NADC30-like PRRSV与HP-PRRSV，见图2。

4 诊断

根据临床诊断、病理剖检、细菌的分离培养及RT-PCR检测，确诊该猪场送检患病猪为NADC30-like毒株与HP-PRRSV毒株混合感染。

表3 扩增目的基因的引物及大小

图2 PRRSV NSP2基因部分片段扩增结果

5讨论

近年来，猪蓝耳病病毒仍然是猪呼吸道问题的主要因素，因猪蓝耳病病毒具有高度的变异性，当前蓝耳病疫苗的接种对疫病的防控很难达到满意的效果，且由于乱用疫苗，导致我国部分猪场出现PRRSV不同毒株混合感染的情况。另外从临床检测来看，NADC30-like PRRSV有逐渐扩大的趋势。因此，猪场应慎重选用高致病性猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗免疫接种，高建华[2]认为对于疫情相对稳定的猪场，一般不推荐使用高致病性猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗。周磊[3]认为采用生物安全控制措施、闭群技术、后备母猪驯化和PRRSV检测与淘汰等措施综合措施是防控 PRRS的明智之举。