一株猪圆环病毒2型SY-12株的分离鉴定

李秋菊，孙明梅 ，费景春，潘志忠，魏 星

（1.松原职业技术学院，吉林 松原 138000；2.辽源市动物疫病预防控制中心，吉林 辽源 136220）

猪圆环病毒 2型 （Porcine Circovirus type 2，PCV2）感染是一种以断乳猪进行性消瘦、呼吸困难、腹泻及明显的淋巴组织病变为主要特征的疾病［1-3］。研究表明，PCV2感染除了造成PMWS外，同时还与猪呼吸道综合症、猪皮炎和繁殖障碍等密切相关［4-5］。PCV2经常与猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)或猪细小病毒(PPV)并发感染或继发细菌感染,使患病猪病情加重,导致基因缺失突变[6]。所以，通过当地流行毒株进行PCV2的分离鉴定，筛选免疫原性较强的毒株用于制备PCV2灭活疫苗，对PCV2防控具有十分重要的意义。

1 试验材料

1.1 病料来源

从松原地区某发病猪场采集疑似猪圆环病毒感染病猪的腹股沟淋巴结，共12份。

1.2 试验材料

PK15细胞，PCV检测为阴性，由本公司研究室保存；基因组提取试剂盒、切胶回收试剂盒、质粒小提试剂和索莱宝公司Ex Taq DNA Ploymerase工具酶，购自TaKaRa公司；MEM培养基和胎牛血清，均购自Invitrogen公司。

2 试验方法

2.1 病料处理

取疑似猪圆环2型病变肠系膜淋巴结和腹股沟淋巴结，加入5 mL MEM(含青霉素最终浓度为100U/mL、链霉素100U/mL)生长液研磨。加入3 mL氯仿，充分混匀，12000 rpm/min离心20 min。吸取上清液用0.22 um过滤除菌。将病毒悬液1 mL接种于长成单层的PK-15细胞，37℃ 5% CO2感作50 min，补充2% MEM营养液继续培养24 h。弃上清液，用终浓度为0.3的M D-氨基葡萄糖37℃处理30 min。弃掉0.3的M D-氨基葡萄糖液，用MEM洗涤2次，用2%胎牛血清与双抗的MEM继续培养2～3 d，收集细胞毒液。

2.2 PCR鉴定与分型鉴定

根据已发表的PCV2序列设计PCV ORF2引物：ORF2F:5'-GCGGATCCGTGACGTATCCAAG-3'，ORF2R:5'-CACTAGTATAGGGGTTAAGTGGGG-5'，产物长度为702 bp；同时，设计另一对引物克隆其余部分基因片 段，FragLF：5'-GAATTCCTGCGGGGGCG GTGTCTTCT-3'；FragLR：5'-GTCGACCAATCCCCC AACCCTTGCCTACC-3'，产物长度为 1373 bp；并合成PCV2分型鉴定引物，以区别PCV2a和 PCV2b，PCV2aF：5'-CCAGTTCGTCACCCTTTCC-3'，PCV2a R：5'-GGGG GACCAACAAAATCTC-3'， 扩增长度为550 bp；PCV2b F：5'-GTGGTCTACATTT CCAGC AGTT-3'，PCV2bR：5'-GCTCAAACCCCCG CTC-3'，提取病毒 DNA，PCR反应体系：10×PCR 缓冲液2.0 μL、dNTPs 0.5 μL、CEU、CED 各 0.5 μL、Ex Taq DNA Ploymerase 0.25 μL、细胞总 DNA1.0 μL 和灭菌水15.40μL，总体积为20.0 μL。 PCR反应条件：95 ℃3 min，95 ℃1 min，65 ℃1 min，72 ℃1 min，共 35 个循环；72℃10 min。将PCR产物切胶回收，并连接转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，对重组质粒进行PCR鉴定，鉴定阳性质粒测序。

2.3 核苷酸序列测定与同源性分析

将测序结果利用GenBank中BLAST软件进行同源性对比分析。

2.4 病毒形态观察

将冻融3次收获的病毒培养液在12000转/min离心30 min，除去细胞碎片。取上清液用2%磷钨酸染色，透射电镜观察病毒粒子。

2.5 特异性鉴定

取PCV2强毒SY-12株病毒细胞培养物1 mL，加入等体积的PCV2阳性血清，37℃培养1 h。取200 μL接种于单层PK-15细胞，同时设不加血清的病毒对照和阴性血清对照。置37℃ CO2培养箱中24 h，换含3 mmol/L D-氨基葡萄糖盐酸MEM维持液，继续培养48 h。弃去维持液，用PBS洗涤3次，冷丙酮固定，150 μL/孔4℃ 30 min。 弃丙酮， 室温下干燥，用PBS洗涤1次。加入工作浓度的鼠抗PCV2 CAP单抗，50 μL/孔37℃ 1 h。用PBS洗涤3次，加入工作浓度FITC标记的羊抗鼠二抗，50 μL/孔，37 ℃ 1 h； 移去孔内液体，用PBS洗涤3次。荧光显微镜下观察。

3 结果

3.1 病毒分离

病毒分离见图1。

图1 病毒分离（PCV2 SY-12F0）染色结果

3.2 PCR鉴定及分型鉴定结果

采用PCV2引物通过PCR对疑似病例的淋巴组织进行扩增,经琼脂糖凝胶电泳后观察到2条长度约为702 bp和1375 bp的电泳条带,与预期的片段大小一致(见图2)。PCV2 SY-12株分型鉴定结果见图3。扩增出330 bp具有PCV2b特异的片段，无PCV2a特异550 bp的特异片段，对照细胞中没有PCV2a和PCV2b特异片段。上述结果说明，PCV2 SY-12株为PCV2b型毒株。

图2 PCR鉴定结果

图3 PCV2a,PCV2b分型扩增鉴定结果图

3.3 序列测定和同源性分析结果

对克隆片段ORF2基因与XS基因分别测序，序列分析后，经拼接得到SY-12株PCV2的部分基因序列为1767 bp，与GenBank中欧洲株亲缘关系最近，与AF055394序列同源性达99.8%。该株全基因序列如图4。编码氨基酸的分子演化分析结果如图5。

图4 PCV2 SY-12株部分氨基酸序列

图5 PCV2 SY-12株与其他毒株氨基酸序列同源性比较

3.4 病毒形态电镜观察结果

病毒培养液经冻融后离心取上清液，2%磷钨酸负染后显微镜下观察到圆环病毒粒子 (箭头所示如图6)。

图6 电镜下观察到的细胞分离物中的圆环病毒粒子

3.5 特异性鉴定结果

将PCV2阳性血清中和分离到的PCV2第3代病毒经荧光抗体染色，结果和正常感染病毒相比，荧光斑数量减少70%，病毒对照接种细胞孔和阴性血清作用细胞孔内均可见大量绿色荧光。

4 讨论

猪圆环2型病毒自1997年发现至今，已证实与猪群中发生的许多疾病密切相关。因此，开展PCV2研究具有重要意义。本试验通过对疑似感染的组织样品进行PCV2-ORF2核酸检测，确定该病料经PCV2感染后再用PK-15细胞进行病毒分离培养，通过间接免疫荧光鉴定及电镜鉴定，证实该病毒为猪圆环病毒2型，即PCV2-WH株。同时将SY-12分离毒株与Gen Bank中已发表的国内外PCV2毒株进行核苷酸序列同源性分析，结果表明SY-12分离毒株与其他毒株核苷酸序列同源性达99.7%。本研究分离的SY-12分离株为吉林省做好该病的防治工作提供了科学依据。由于猪圆环病毒2型（PCV2）的生物学特性特殊，病毒在所有细胞中增殖的滴度不高，在细胞中复制需要依赖细胞生长周期S期的细胞表达蛋白。用D-氨基葡萄糖处理细胞培养物后有利于病毒的复制，感染细胞数量可提高30%。本试验用PCR检测得到的PCV2阳性病料经处理后接种PK-15细胞，然后用D-氨基葡萄糖处理，连续盲传后进行荧光定量PCR及IFA检测，分离到SY-12株，为进一步从分子水平研究PCV2在吉林省的流行、变异规律以及主要结构基因的特性奠定了基础，也为吉林地区PCV2的诊断及预防奠定了基础。

图7 PCV2 SY-12株（F3）特异性鉴定结果