橘皮苷对百草枯致肺纤维化小鼠细胞外基质转化干预作用及Fas/FasL 蛋白表达的机制研究

陈 宏，张佩颖，赵建云，王文增，张明浩，李可心，邓琳千，宋倩男*

（1.黑龙江省中医药科学院，哈尔滨 150036；2.黑龙江中医药大学附属第一医院儿科，哈尔滨 150040）

肺纤维化（pulmonary Fibrosis，PF）是间质性肺疾病（interstitial lung disease,ILD）常见的临床病理改变；以成纤维细胞的大量增殖及细胞外基质聚集为主要病变特征[1]；呼吸衰竭是肺纤维化患者的最终临床表现。患者的中位生存时间为2～3 年，5 年病死率达40%。肺纤维化的致病因素广泛，空气污染，各种粉尘，射线损伤，某些药物和疾病及病毒感染（SARS及2019-nCoV）等均可以引起肺纤维化[2-3]。现阶段肺纤维化的治疗依旧是临床难题，其病因不明、发病机制不清楚，无法进行有效的针对性治疗[4-5]。过去的治疗方式主要以糖皮质激素及免疫抑制剂治疗为主[6]，越来越多的临床研究数据表明，这些治疗方法效果并不理想[5,7]。本实验拟进一步对橘皮苷对百草枯致肺纤维化小鼠细胞外基质转化的干预作用及Fas/FasL 蛋白表达的机制进行研究，为其临床应用提供数据支持，报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取同批饲养的雄性C57 小鼠60 只，体质量（24.3±3.6）g，8～10 周龄，购于青龙山动物繁殖中心[许可证号：SCXK（苏）2017-0001]，饲养于本院动物实验中心，环境温度保持（23±1.5）℃，相对湿度保持（50±3.5）%，所有小鼠均给予相同的常规自由饮食。本研究通过动物实验伦理审查委员会审查批准。实验开始前，小鼠在洁净级动物房适应性喂养1 周，实验期间小鼠自由饮水和进食。

1.2 药品及试剂 橘皮苷（HES）（上海贤鼎生物科技有限公司），百灵威科技有限公司生产的百草枯（浓度＞98%），南京建成生物工程研究所生产的苏木精-伊红染色、Masson 染色、一氧化氮合酶及还原性谷胱甘肽试剂盒，北京天根技术有限公司生产的逆转录试剂盒，北京方程生物科技有限公司生产的E-Cadherin，Vimentin，MMP2 和NF-κB 试剂盒。

1.3 实验仪器 TS100 型倒置显微镜及其配套图像采集系统；Eppen-dorf 公司的5417R 高速低温离心机和移液器，北京瑞丽分析仪器公司生产的UV9600 分光光度计，MJ Research 公司生产的PTC-200 型PCR 仪器。

1.4 方法

1.4.1 小鼠模型复制、分组及给药 正常组注入等量生理盐水（2 mg/kg），百草枯模型组利用百草枯水溶液灌胃建模。在建模后第1 周，给予小鼠药物治疗，地塞米松组采用腹腔注射方式按2 mg/（kg·d）剂量给予地塞米松，橘皮苷组每次用橘皮苷灌胃。每天给药1 次，观察小鼠的生活状态及体质量，给药3 周后进行药效检测。将60 只雄性昆明小鼠随机分为Blank组、Model 组、HES（H）组、HES（M）组、HES（L）组和DEX 组，每组10 只。

1.4.2 动物标本收集与处理 造模3 周后，将小鼠处死收集标本，血液离心后将血清冷冻保存，检测一氧化氮、谷胱甘肽等氧化指标；将小鼠解剖后，分离其新鲜肺组织并称重。小鼠左肺组织固定处理后，石蜡包埋并进行切片处理，然后根据试剂说明进行HE 染色及Masson 染色操作，并置于显微镜下进行观察记录，小鼠右肺组织分置冻存管，迅速置入液氮罐后保存，观察记录相关因素水平指标。

1.4.3 检测方法 给药3 周后，将各组小鼠称重，然后进行眼球静脉丛取血每样品1 mL，用于测定血浆中的TNF-α、IFN-γ、TGF-β1含量，肺脏组织 MDA、MPO 水平；取血后断颈处死小鼠，取小鼠肺组织称重，将左肺冻存于-80℃冰箱中，用于胶原百分含量的测定；将右肺组织经10%福尔马林固定，固定后用流水冲洗掉肺组织表面的固定液，常规脱水、制作石蜡组织切片，进行苏木素-伊红（HE）染色及MASSON染色。在显微镜下观察肺组织的形态学变化以及胶原百分含量的变化。

1.4.4 Fas/FasL 免疫组化染色 按照生物素—链霉卵白素免疫组化检测试剂盒说明进行，将肺组织切片常规脱蜡至水，抗原修复15 min，以3% H2O2消除内源性过氧化物酶活性，血清封闭，滴加一抗 4 ℃过夜，PBS 冲洗，滴加二抗和辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液，经 DAB 显色、苏木素复染、脱水、透明、封片。镜下观察棕黄色或棕褐色颗粒为阳性细胞。每张玻片随机计数 10 个视野，通过Image-Pro plus 5.1 半定量分析免疫组化的染色结果，以光密度值表示。

1.4.5 药物对肺上皮细胞EMT-like 转变的影响 由于EMT-like 转变在肺纤维化过程中发挥着重要的调节作用，本研究将关注橘皮苷对EMT-like 的影响，研究其对肺上皮细胞A549 的EMT-like 影响，并分析其对EMT-like 相关的信号通路（TGF-β1，NF-κB 等）的影响，确定其影响的主要信号通路。利用双荧光素酶报告基因实验检测药物对EMT-like 标志物（E-Cadherin,Vimentin），MMP2，NF-κB 等的影响，分析其影响的关键转录因子；并利用Western-blot 方法对该转录因子的下游通路进行验证。

1.4.6 评分标准 0 级，无肺间质纤维化；1 级，轻度肺间质纤维化，病变范围局限在全肺20%以下；2 级，中度肺间质纤维化，病变范围占全肺的20%～50%，肺泡结构紊乱；3 级，重度肺间质纤维化，病变范围＞50%，肺泡融合，肺实质结构紊乱。

1.5 统计学方法 采用SPSS 25.0 将收集到的数据进行处理与分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，予t检验。计数资料用率（%）表示，予χ2检验，P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 肺组织病理学观察 肺纤维化建模后，开始给药橘皮苷，连续给药4 周。将小鼠的肺组织解剖后进行HE 染色。实验结果显示，模型组小鼠的肺组织严重破坏，肺泡结构消失，大量纤维组织增生；与肺纤维化模型组相比，给药橘皮苷组小鼠的肺组织肺纤维化程度明显改善，肺泡结构相对更加完整。见图1，图2。

图1 橘皮苷给药第4 周肺组织染色结果（HE，×400）

图2 橘皮苷给药第4 周肺组织染色结果（Masson，×400）

2.2 橘皮苷对肺纤维化中关键信号通路蛋白表达的影响 利用免疫组化的方法，对肺纤维化中的关键信号通路如EMT-like 标志物（E-Cadherin,Vimentin），MMP2，NF-κB 等的表达进行了检测，发现橘皮苷可以抑制EMT-like 过程，增加MMP2 的表达，抑制NF-κB 的表达。见图3。

图3 橘皮苷对肺纤维化中关键信号通路蛋白表达影响

2.3 橘皮苷对百草枯致小鼠肺组织 Fas/FasL 表达的影响 细胞胞质呈棕黄色颗粒表达的细胞即为 Fas/FasL表达阳性细胞，Model 组见肺组织阳性细胞明显增多，Fas 主要表达在肺泡上皮细胞，FasL 主要表达在肺泡上皮细胞、炎性细胞、部分间质细胞及支气管上皮细胞，Blank 组只有少量的阳性细胞。与Model 组相比，HES（H）组、HES（M）组、HES（L）组和DEX 组有显著性差异（P＜0.01），采用橘皮苷（HES）发现，HES（H）组、HES（M）组、HES（L）组和DEX 组肺组织 Fas/FasL 表达明显减少，HES（H）组与HES（M）组、HES（L）组和DEX 组比较差异显著（P＜0.05）。见表1。

表1 橘皮苷对百草枯致小鼠肺组织 Fas/FasL 表达影响（，n =10）

表1 橘皮苷对百草枯致小鼠肺组织 Fas/FasL 表达影响（，n =10）

注：与Blank 组比较，## P ＜0.01，# P ＜0.05；与Model 组比较，△P ＜0.05；与HES（M）组和HES（L）组比较，▲P ＜0.05

3 讨论

根据最新的治疗指南（2015 版），目前临床用于治疗IPF 的药物主要为吡非尼酮及多重酪氨酸激酶抑制剂尼达尼布（有条件的推荐使用）[8-9]；其次为N-乙酰半胱氨酸、双重内皮素受体抑制剂波生坦以及马西替坦（有条件的不推荐使用）[9]。这些药物存在着不同程度的副作用并且治疗效果并不理想。此外，上述药物临床治疗费用较高，每人每年可达数万元，患者负担较重[10-11]。因此，从中药单体中寻找抗肺纤维化的有效成分，并且阐明其药理机制，对于其临床应用及新药开发具有重要的意义。药物开发成功将具有重大的社会意义。

橘皮苷，即维生素P 黄酮类化合物之一，主要存在于柑橘属果实中，尤其是柑、橘、甜橙和柠檬等的果皮中含量较多[12]。分离提取的橙皮苷精制品为白色粉末，微小针状晶体。橘皮苷是维生素P 的重要组成部分，具有软化血管的作用。本研究成功建立了百草枯诱导的小鼠肺纤维化的模型及百草枯及病毒诱导的肺纤维化模型，并且建立了完善的肺纤维化药效评价体系，包括细胞因子检测，HE 染色及纤维化程度评分，胶原含量检测等。本研究结果显示，中草药植物的萃取物因其富含多酚类与多样的药理特性，而被用于抗炎、抑菌，柑橘类植物中富含的类黄酮素多酚（flavonoid），传统中药中陈皮也富含此成分，研究证实橘皮苷具有抗辐射伤害、抗过敏、抗菌、抗氧化的多种药理作用。相关研究[13]认为橘皮苷能够抑制许多前发炎细胞激素包含IL-6、IL-1β 以及iNOS，因此有相当的潜力可抑制炎症与破坏。

基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP），又被称为matrixins，由多个同源内胜肽酶家族组成，此类蛋白质具有分解细胞外基质功能，结构上具有多段相似的构造以及带有金属离子的催化分解区域，进行生理作用时对于锌和钙离子依赖性高，这些金属离子能够帮助稳定酵素的立体结构；大多数细胞可以制造数种MMP，大部分MMP 初始以前酶原形式被制造出来，此阶段蛋白不具有酵素活性，需要通过活化才具备活性。正常情况下MMP 活性受到严格调控，以防止过度的蛋白分解造成组织的破坏。本研究发现，橘皮苷能够增加MMP2 的表达。

Fas 是肿瘤坏死因子受体（TNFR）和神经生长因子（NGF）受体家族的细胞表面分子，Fas 配体（Fas ligand，FasL）是TNF 家族的细胞表面分子。FasL 与其受体Fas 结合导致携带Fas 的细胞凋亡。研究表明，多种哺乳动物细胞表达Fas，而FasL 仅表达于活化的T 细胞。在免疫系统中，Fas 和FasL 参与反应的下调及T 细胞的细胞毒作用。Fas 和FasL 可因基因突变而丧失功能，导致淋巴增殖性疾病发生以及自身免疫加剧，因此系统的功能过强可导致组织破坏。Fas 是人们在研究膜蛋白抗体的溶细胞作用时被发现的，进而从细胞溶T 细胞系分离了Fas 的配体FasL，从而建立了Fa/FasL 细胞凋亡信息传递系统。因此，橘皮苷对于百草枯（PQ）导致的小鼠肺纤维化具有保护作用，降低Fas/FasL 表达，表明橘皮苷对百草枯致肺纤维小鼠纤维化改善与 Fas/FasL 凋亡通路有关。