芍药苷对DSS诱导大鼠慢性溃疡性结肠炎IL-17表达的影响①

司晓丽 王 烨 王 卓 李兰珍 朱向东 （甘肃中医药大学基础医学院，兰州 730000）

溃疡性结肠炎是一种病因尚不明确的慢性炎性肠病，其发病机制与环境、遗传、免疫等因素有关［1］。疾病活动期，肠道上皮黏膜屏障破坏，肠道内病原体向固有层转移，免疫细胞被激活，产生大量TNF-α、IFN-γ、IL-6等促炎细胞因子，诱导上皮细胞凋亡，连接蛋白表达下调，肠上皮通透性增加，加重组织损伤［2］。自噬是真核生物细胞内长半衰期蛋白质的降解途径，可通过降解受损的细胞器或细胞内的病原体，修复受损的肠上皮，刺激宿主产生防御肽，启动适应性免疫，维持内环境的稳定，被认为是先天免疫的核心［3］。在DSS诱导的急性UC动物模型中发现自噬相关基因ATG7表达下降，提示肠上皮细胞自噬功能下降，肠道内环境被破坏，导致了肠道先天免疫的异常［4］。

白芍是一种常见的补益药材，为毛茛科植物芍药Paeonia lactifloraPall.的根，芍药苷（Paeoniflorin）是其主要的活性成分，一种单萜糖苷。本团队前期研究证实芍药苷能够调节肠道异常免疫反应，修复TNBS/乙醇液诱导的肠道溃疡，具有抗炎、免疫调节作用［5］。也有研究报道芍药苷能够降低IL-17A、IL-17F及TNF-α等Th17细胞相关因子mRNA的表达，减少病变部位炎细胞浸润、表皮细胞增殖及异常分化［6］。IL-17是由native CD4+T细胞来源的Th17细胞分泌产生的一种前促炎因子。Meta分析表明IL-17遗传多态性和血清水平可能与溃疡性结肠炎风险增加有关，患者外周血IL-17水平显著升高，且IL-17水平与疾病病变程度显著相关［7-8］。此外，血清剥夺或雷帕霉素（rapamycin，自噬诱导剂）处理的人表皮Ha‑CaT细胞给予100 ng/ml人重组IL-17A刺激后，LC3Ⅱ蛋白水平显著下降，提示自噬在IL-17A介导的皮肤炎症中活性下降［9］。在溃疡性结肠炎中，自噬与IL-17的关系鲜有报道，本研究旨在观察IL-17及自噬相关因子LC3BⅡ、Beclin1在DSS诱导的UC大鼠模型中的表达水平，探讨芍药苷可能的干预机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物70日龄SPF级雄性Wistar大鼠，40只，体重（200±20）g（购自甘肃中医药大学实验中心，No.62001000000324），饲养于通风、温度（23±2）℃、相对湿度（55±15）%环境，每日光照12 h，自由摄食饮水。

1.1.2 药物与试剂DSS购自美国MP公司；芍药苷（批号：C10010107，含量≥98%）购自上海麦克林生化科技有限公司；柳氮磺吡啶购自上海信宜天平药业有限公司；兔抗IL-17、LC3B抗体购自GeneTex公司；兔抗Beclin1抗体购自Cell Signaling公司；IL-17、ICAM ELISA试剂盒购自Mibo公司；TNF-αELI‑SA试剂盒购自欣博盛生物；SP免疫组化试剂盒购自中山金桥；羊抗兔IgG二抗、β-actin单克隆抗体购自Immuno Way公司；PBS磷酸盐缓冲液干粉购自Solarbio公司；水合氯醛购自国药集团化学试剂有限公司；胶体金法大便潜血检测试剂盒购自郑州方欣生物科技有限责任公司。

1.2 方法

1.2.1 DSS诱导慢性溃疡性结肠炎模型的建立 参考文献［10］制作相关模型，如图1所示，30只大鼠于第1天开始连续7 d给予添加2%DSS的蒸馏水自由饮用，随后给予无添加的蒸馏水连续饮用14 d。如图1所示，上述DSS+蒸馏水饮用进行3个循环。另取10只大鼠给予无添加蒸馏水作为空白对照组。在添加DSS的蒸馏水饮用期每日观察并记录大鼠体重、粪便性状及便血情况。

图1 慢性溃疡性结肠炎大鼠模型建立方法Fig.1 Experimental protocol to establish rat model of chronic ulcerative colitis

1.2.2 分组和给药 区组随机法将30只造模成功大鼠分为DSS组、DSS+芍药苷组和DSS+柳氮磺吡啶组，每组10只大鼠。其中，柳氮磺吡啶作为阳性对照。按照人与动物用药剂量折算成大鼠用药量，芍药苷根据前期研究自造模后第1天开始2.5 g/（kg·d）灌胃［5］，柳氮磺吡啶0.5 g/（kg·d）灌胃，空白对照组以及DSS组给予等体积生理盐水灌胃，隔天灌胃给药1次，各组连续给药干预21 d。

1.2.3 DAI评分 参照文献［11］，计算各组大鼠每轮添加DSS的蒸馏水饮用后DAI的值（DAI=体重减轻指数+粪便形状指数+便血指数），评分标准见表1。

表1 DAI评分标准Tab.1 DAI scoring criteria

1.2.4 ELISA法检测外周血IL-17、TNF-α及ICAM的含量 新鲜配制7%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，腹腔静脉抗凝采血，2 000 r/min离心15 min，收集血浆，按照说明书要求，将血浆、ELISA试剂于室温下平衡30 min；酶标板中，设空白孔，孔内加100µl标准品&标本稀释液；设反应孔，每孔内加入100µl标本或不同浓度标准品，封板胶纸封住反应孔37℃孵育90 min；洗板5次；空白孔内加入100µl生物素化抗体稀释液，反应孔内加入100µl生物素化抗体工作液，37℃继续孵育60 min；洗板5次；空白孔加入100µl酶结合稀释液，反应孔内加入100µl酶结合工作液，37℃继续孵育30 min；洗板5次；每孔加入100µl的TMB显色，避光37℃继续孵育15 min；每孔加入100µl终止液终止反应，酶标仪450 nm读板并记录数据，ELISACalc.exe回归/拟合计算软件V0.1计算样本IL-17、TNF-α及ICAM的含量。

1.2.5 免疫组化法检测结肠组织IL-17蛋白表达 取病变肠组织纵行切开，预冷生理盐水冲洗肠道，病变严重段置于10%福尔马林固定，常规石蜡包埋结肠组织并连续切片，脱蜡水化，pH6.0枸橼酸盐缓冲液抗原修复，5%BSA 37℃孵育30 min，加入适当比例稀释的一抗（IL-17 1∶100），置于4℃冰箱过夜。次日37℃复温45 min，加入生物素标记的二抗，室温下孵育30 min，DAB显色，苏木精复染20 min，中性树胶封片，光学显微镜下观察并摄片，Image J图像分析软件测定IL-17阳性区域平均吸光度值。

1.2.6 Western blot法检测结肠组织IL-17、LC3B、Beclin1蛋白水平 取各组结肠组织剪碎，置于预冷的破璃容器中，加入裂解液制备组织匀浆，12 000 r/min离心5 min，取上清测定蛋白浓度。各组分别取等量蛋白上样，经电泳分离后，PVDF膜300 mA恒流转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h；加一抗（IL-17 1：2 000、LC3B 1：1 000、Beclin1 1：2 000），4℃冰箱过夜。次日，PBST洗膜4次，每次8 min；避光条件下敷二抗轻摇2 h，PBST洗膜4次，每次8 min；加ECL发光液，化学发光成像仪（上海勤翔科学仪器有限公司）曝光拍照，Image J图像分析软件分析条带灰度值，以β-actin为内参计算IL-17、LC3B、Beclin1的相对蛋白表达量。

1.3 统计学分析 采用SPSS23.0统计软件包进行统计处理，所有指标均以±s表示，组间差异比较采用方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 芍药苷对DAI评分的影响 空白对照组大鼠饮食、饮水尚可，未见明显体重下降及血便，偶有软便。DSS组大鼠随着DSS饮用时间的增长，大鼠食纳减少，毛色粗糙，体重显著下降，粪便软散或便溏，次数增加，肛周污浊，严重者肉眼可见血便，未出现死亡，DAI评分结果见表2，结果显示与空白对照组相比，DAI评分显著增高（P＜0.01）。与DSS组大鼠相比，治疗组大鼠DAI评分显著降低（P＜0.05），食纳及体重增加，便溏及血便减少。

表2 各组大鼠DAI评分（±s，n=10）Tab.2 DAI scores of rats in each group（±s，n=10）

表2 各组大鼠DAI评分（±s，n=10）Tab.2 DAI scores of rats in each group（±s，n=10）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05，2）P＜0.01；compared with DSS group，3）P＜0.01.

Third round 0.3±0.93）9.7±2.02）4.1±2.92）3）3.5±2.42）3）Groups Control DSS DSS+Paeoniflorin DSS+Sulfasalazine First round 0.4±0.83）4.7±1.62）2.4±1.72）3）1.9±1.31）3）Second round 0.5±1.13）7.8±1.82）3.8±2.12）3）3.2±1.92）3）

2.2 芍药苷对外周血IL-17、TNF-α及ICAM含量的影响ELISA结果如表3所示：与空白对照组相比，DSS组大鼠外周血中IL-17、TNF-α及ICAM含量显著升高（P＜0.01）。与DSS组相比，DSS+芍药苷组、DSS+柳氮磺吡啶组大鼠外周血IL-17、TNF-α及ICAM含量显著降低（P＜0.05）。

表3 ELISA检测外 周血IL-17、TNF-α及ICAM的含量（±s，n=10）Tab.3 Levels of IL-17，TNF-αand ICAM in peripheral blood were detected by ELISA（±s，n=10）

表3 ELISA检测外 周血IL-17、TNF-α及ICAM的含量（±s，n=10）Tab.3 Levels of IL-17，TNF-αand ICAM in peripheral blood were detected by ELISA（±s，n=10）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05，2）P＜0.01；compared with DSS group，3）P＜0.05，4）P＜0.01.

ICAM（pg/ml）107.4±10.44）212.5±11.52）151.3±19.81）4）128.4±16.51）4）Groups Control DSS DSS+Paeoniflorin DSS+Sulfasalazine IL-17（pg/ml）71.6±7.44）135.3±13.72）94.2±10.11）4）81.0±15.94）TNF-α（pg/ml）68.3±9.14）119.3±15.12）95.7±19.01）3）83.5±19.44）

2.3 芍药苷对大鼠结肠组织IL-17蛋白表达的影响 免疫组化结果如图2所示，IL-17阳性表达主要见于黏膜层细胞的胞浆内，细胞间质及细胞核未见明显表达。Image J图像分析软件结果如表4所示，与空白对照组相比，DSS组大鼠结肠组织IL-17阳性区域吸光度值显著增加（P＜0.01）。与DSS组相比，DSS+芍药苷组、DSS+柳氮磺吡啶组大鼠结肠组织IL-17阳性区域吸光度值显著降低（P＜0.01）。

图2 免疫组化测定芍药苷对结肠组织IL-17蛋白表达水平的影响（×200）Fig.2 Effect of paeoniflorin on expression of IL-17 pro-tein in colon tissues was determined by immunohis-tochemistry（×200）

表4 结肠组织IL-17阳性区域吸光度值（±s，n=10）Tab.4 Absorbance value of IL-17 positive area in colon-tissue（±s，n=10）

表4 结肠组织IL-17阳性区域吸光度值（±s，n=10）Tab.4 Absorbance value of IL-17 positive area in colon-tissue（±s，n=10）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05，2）P＜0.01；Compared with DSS group，3）P＜0.01.

Absorbance value 0.273±0.0783）0.354±0.0312）0.251±0.1093）0.237±0.0241）3）Groups Control DSS DSS+Paeoniflorin DSS+Sulfasalazine

2.4 芍药苷对大鼠结肠组织IL-17、LC3B、Beclin1蛋白水平的影响Western blot结果如图3、表5所示，与空白对照组相比，DSS组结肠组织IL-17蛋白水平显著增加，LC3BⅡ及Beclin1蛋白水平降低（P＜0.01）；与DSS组相比，DSS+芍药苷组和DSS+柳氮磺吡啶组结肠组织IL-17蛋白水平显著降低（P＜0.01），LC3BⅡ及Beclin1蛋白水平增加（P＜0.05）。

图3 IL-17、LC3BⅡ及Beclin1在各组大鼠结肠组织中的表达Fig.3 Expression of IL-17，LC3BⅡand Beclin1 in colin tissues of rats in each group

表5 Western blot检测结肠组织IL-17、LC3BⅡ及Beclin1的相对表达水平（±s，n=10）Tab.5 Relative expression levels of IL-17，LC3BⅡand Beclin1 in colon tissues were detected by Western blot（±s，n=10）

表5 Western blot检测结肠组织IL-17、LC3BⅡ及Beclin1的相对表达水平（±s，n=10）Tab.5 Relative expression levels of IL-17，LC3BⅡand Beclin1 in colon tissues were detected by Western blot（±s，n=10）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05，2）P＜0.01；compared with DSS group，3）P＜0.05，4）P＜0.01.

Beclin1/β-actin 0.347±0.0444）0.239±0.0302）0.321±0.0402）3）0.469±0.0591）4）Groups Control DSS DSS+Paeoniflorin DSS+Sulfasalazine IL-17/β-actin 0.869±0.0354）1.247±0.0182）0.974±0.0231）4）0.841±0.0314）LC3Ⅱ/β-actin 1.050±0.0344）0.742±0.0262）0.878±0.0422）3）0.917±0.0211）4）

3 讨论

目前，关于UC的病因与发病机制，研究普遍认为环境因素（传染病、药物、饮食、压力等）作用于遗传易感者，在肠道菌群的参与下，肠道先天免疫异常导致适应性免疫紊乱（Th1/Th2调节失衡和Th17/Treg转化失衡），炎性因子分泌，反向增加先天免疫损伤，形成恶性循环，最终导致炎症的发生［2］。IL-17家族通常被认为是连接先天免疫和适应性免疫的桥梁［12］，其与受体结合后，可激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）以及核转录因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）等信号通路刺激内皮细胞产生IL-6、IL-8、TNF-α、粒细胞-巨噬细胞刺激因子（granulocyte-macrophage colonystimulating factor，GM-CSF）、细胞间黏附分子-1（in‑tercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）等细胞因子和CXCL-1、CXCL-6及CXCL-8等趋化因子，进而导致单核细胞、中性粒细胞募集及炎症的产生［13-14］。

DSS是一种人工合成的硫酸盐多糖，动物经多个循环自由饮用可诱发以血便、黏膜溃疡、炎细胞浸润为主要病理改变的慢性溃疡性结肠炎，其作用机制可能与肠道菌群失调、肠道上皮细胞增殖受抑制、破坏肠道黏膜屏障、巨噬细胞功能障碍等有关，其与人类UC病理改变接近［10］。本研究结果显示芍药苷治疗后，DSS诱导产生的炎症因子IL-17、TNFα、ICAM的含量及IL-17蛋白表达降低，表明芍药苷能够缓解DSS对肠道的炎症反应。

有报道显示，在肺上皮细胞中IL-17A通过激活GSK-3β通路抑制自噬，给予IL-17A阻断剂则可激活自噬而减轻小鼠肺纤维化［15］。在人HaCaT细胞中，IL-17A同样可以下调LC3Ⅱ的表达，其机制可能与上调自噬负性调节因子mTOR信号通路有关。然而，IL-17与自噬在UC中的关系鲜有报道。LC3/Atg8是较为广泛应用于检测自噬体的标志分子，LC3Ⅱ水平或LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值可反映细胞自噬的活性［16］。Beclin1/Atg6是ClassⅢPI3K复合物的组成部分，涉及自噬体的形成［17］。本研究Western blot结果可见，溃疡性结肠炎大鼠结肠组织中LC3BⅡ及Beclin1蛋白水平显著低于空白对照组，结合已有研究报道显示自噬缺陷可能在炎症性肠病中起重要作用［18-19］。芍药苷治疗后，LC3BⅡ及Beclin1蛋白水平增加，提示芍药苷可能通过上调自噬水平减轻DSS对大鼠肠道的损伤。

本研究仅对IL-17及自噬相关蛋白LC3B、Be‑clin1在DSS诱导的UC大鼠模型中的表达情况进行了观察，而在UC中IL-17通过何种信号通路调节自噬以及自噬在UC发病机制中的作用将是今后工作的重点。