HPLC法在《中国药典》的应用与展望

柯 颖，洪小栩

(1 中国药科大学，南京 210009；2 国家药典委员会，北京 100061)

高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)法是20世纪60年代初期在经典柱色谱基础上创立的一种分离分析技术，汲取了气相色谱(GC)法的发展经验。与经典色谱法相比，HPLC法具有分离效率高、分析时间短、检测灵敏度高等优势[1]。HPLC法在药品研发和质量控制等领域应用广泛，涉及药品检验的各个方面，如药品鉴别、杂质控制、含量测定等。HPLC法首次收载于《中国药典》1985年版，在药品质控中的应用日益广泛，目前已成为药品安全性、有效性控制最重要的检测方法。

1 基本原理与类型

HPLC法与经典液相色谱法有所不同，基本原理是以液体为流动相，在高压下利用不同组分与固定相和液体流动相的吸附能力、离子交换作用以及分配系数的不同而实现分离。根据保留时间的不同，对样品各组分进行定性定量分析[2]。典型的高效液相色谱仪一般具备储液器、高压泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等主要部件。

HPLC法按照固定相和流动相的相对极性可分为正相色谱(normal phase chromatography)和反向色谱(reversed phase chromatography)。两者区别见表1。

表1 正相色谱法与反向色谱法的区别

另外，为适应不同有机化合物的特性，保证绝大多数有机化合物的分离分析，装有不同类型填料的色谱柱与相对应的流动相形成了不同的分离机制。按照分离过程的机制可分为分配色谱(partition chromatography)、吸附色谱(absorption chromatography)、离子交换色谱(ion exchange chromatography,IEC)、分子排阻色谱(size exclusion chromatography,SEC)、亲和色谱(affinity chromatography,AC)。

2 HPLC法在历版《中国药典》的应用

《中国药典》1985年版首次新增了HPLC法，将其收入附录。同时，在二部7个品种的含量测定方法中应用了HPLC法，分别为丙酸睾丸素注射液、叶酸、叶酸片、苯丙酸诺龙注射液、黄体酮注射液、维生素D3注射液、醋酸氟轻松软膏。按品种数量统计，HPLC法在历版《中国药典》中的应用情况见表2和图1。

表2 历版《中国药典》HPLC法收载情况 个

图1 历版《中国药典》HPLC法收载数量趋势

从表2和图1可以看出，从《中国药典》1985年版到2020年版的发展可分为4个时期：1985～2000年为起步期，HPLC法应用品种数目增多但是增长缓慢；2000～2005年为上升期，HPLC法应用品种数目增长明显；2005～2015年为快速发展期，增长最为明显的是《中国药典》2010年版；2015～2020年为平稳期，HPLC法应用品种数目增多但是趋于平稳。

值得一提的是，在HPLC法的快速发展期间，《中国药典》2010年版一部收载品种2165种，采用HPLC法的有1214种，占总数的56%；二部收载品种2271种，采用HPLC法的有1366种，占总数的60%。从最新颁布实施的《中国药典》2020年版来看，一部、二部采用HPLC法的品种分别占总数的66%和72%。由此可见，当前HPLC法已成为《中国药典》中最常用的检测方法。

按检测项目统计，HPLC法在历版《中国药典》中的应用情况见表3、表4和图2、图3。

表3 HPLC法在历版《中国药典》一部不同检测项目中的应用品种数量 个

表4 HPLC法在历版《中国药典》二部不同检测项目中的应用品种数量 个

图2 HPLC法在历版《中国药典》一部不同检测项目应用情况

图3 HPLC法在历版《中国药典》二部不同检测项目应用情况

自《中国药典》1985年版收载HPLC法开始，该法最先应用于化学药品的含量测定，并于《中国药典》1990年版首次增加了HPLC法用于5种中药品种含量测定。HPLC法在药品质量控制方面的应用不断普及，主要用于药品安全性、有效性的质控项目。在化学药品中，应用最普遍的检测项目是鉴别、有关物质和含量测定；在中药中，应用最普遍的检测项目是鉴别和含量测定；在生物制品中，主要用于蛋白质纯度测定。

化学药品除了关注鉴别和含量测定项目以外，对有关物质的控制也格外注重。有关物质是指能影响药物纯度、降低主成分含量的杂质，主要包括生产过程中带入的起始原料、中间体、聚合体、副反应产物、降解产物等[3]。基于安全性考虑，有关物质研究是化学药品质量研究的关键项目，HPLC法常用于化学药品的有关物质含量测定。从图3可以看出，采用HPLC法测定有关物质含量的化学药品品种数量增长迅速。化学药品的鉴别试验也越来越多地采用HPLC法替代红外测定法。在含量测定方面，HPLC法更是首选的“黄金法”。

中药材和饮片作为临床用中成药和汤剂的原料，其安全性和有效性一直是热点话题。针对这两方面的问题，每一版《中国药典》的修订，都把工作重点放在进一步加强中药材和饮片的专属性鉴别和质量控制上。中药材和饮片所含成分结构多样复杂，为鉴别和含量测定带来巨大挑战，给方法学的建立提出了更严格的要求[4]。面对挑战，HPLC法凭借其稳定性和分离的可靠性，为中药材和饮片鉴别和含量测定提供了技术手段，成为突破传统中药质量控制理念、推进质量控制现代化的有力工具。

生物制品的质量标准主要强调安全性、有效性和可接受性。由于受到纯度的影响，药效不能充分发挥，甚至对人体产生毒副作用。因此，生物制品在精制后，要求检查纯度是否符合规定。过去对生物大分子的分离主要依赖免疫电泳法，但有一定的局限性。HPLC法逐渐被开发用于生物制品的纯度测定，以其重复性好、自动化程度高、检测限低(达ng或pg级别)、回收率高且不失活等特点，成为生物制品纯度分析的重要工具。

经过多年的发展，HPLC法的应用范围不断扩大，涉及各个药品品种领域，主要用于鉴别、有关物质检测和含量测定。以往多数采用薄层色谱法进行药物鉴别，优势在于使用简便且成本较低，但是为了寻求更高的准确性，最终被HPLC法替代。采用HPLC法进行含量测定的优势在于分离效率高，可应用于高沸点、热稳定性差的化合物的分离分析，从而替代繁琐的滴定分析法。

3 技术展望

随着各国药品标准的不断提高，以及对分离纯化技术的不断探索，使得HPLC法发展迅速。HPLC法以其高效、准确性好、操作自动化等特点，已经普遍运用于药物分析检测的各个领域[5]。HPLC法最大的优势在于药品的定量检查。目前，HPLC法的发展主要体现在两个方面：一方面，通过革新技术仍保持其在定量领域的优势，要求降低色谱柱颗粒度、加快色谱分离效率；另一方面，为了克服其在定性领域的劣势，通过与其他分析技术联用，如质谱(MS)、飞行时间质谱(TOF-MS)、核磁共振(NMR)等。

3.1 超高效液相色谱法

超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatography，UPLC)是在HPLC法的理论基础上，应用了新型小颗粒填料及装填技术、超高压液相色谱泵、低扩散、低交叉污染的自动进样器以及快速检测手段等全新技术。与传统的HPLC技术相比，能获得更高的柱效，其分离效率、灵敏度和分辨率都有很大的提高。因此，适合于中药复杂成分的分离分析，在中药研究领域发挥了重要作用。

李垚等[6]采用UPLC法测定丹参不同部位中丹参素、原儿茶酸等14种水溶性成分的含量，建立的UPLC法分离度好、灵敏度高，可实现准确定量。陈冉等[7]采用UPLC法测定了鲜川芎和川芎药材中6种活性成分的含量。郭社民等[8]建立UPLC法，采用Acquity UPLC HSS T3色谱柱，可同时测定参杞通脉胶囊中人参皂苷Rg1、Re和Rb1的含量。

3.2 高效液相色谱联用技术

高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)联用技术体现了色谱和质谱优势的互补，以液相色谱作为分离系统，质谱作为检测系统。其检测原理是样品通过液相色谱系统后由色谱柱分离，随后质谱的质量分析器将离子碎片按质荷比分开，经检测器后得到色谱图，分析后可得知色谱峰中所有化学物质的相对分子质量信息，可用于识别分子结构以及纯度的检查，适用于极性强、挥发度低、相对分子质量大且热不稳定的混合有机物体系[9]。HPLC-MS法的优点：高灵敏度、对样品的选择性高以及能对多种样品成分进行定性定量分析[10]。但同时也存在一定的局限性，如复杂样品基质的干扰物会对分析结果产生一定的影响，而基质效应很难消除。HPLC-MS的应用非常广泛，为分子生物学、化合物的表征及鉴定、定量和定性分析、治疗药物监测中的自动免疫分析、临床化学和毒理学等领域提供了一种强有力的检测手段。

近些年发展的液相色谱-光谱技术包括高效液相色谱-二极管阵列(HPLC-PDA)、高效液相色谱-圆二色(HPLC-CD)、高效液相色谱-核磁共振(HPLC-NMR)等。HPLC-PDA法适用于大多数有紫外吸收的物质，可同时检测多个波长，因此可以一次性得到样品所有组分的信息，十分方便，但是对流动相选择有一定的限制[11]。鉴于圆二色检测器的选择性较高，只对具有旋光活性的物质有响应，因此HPLC-CD法在复杂基质中手性化合物的分析以及在手性化合物绝对构型的测定中有很好的应用前景[12]。例如，采用HPLC-CD法分析甲霜灵的对映体纯度[13]。HPLC-NMR法在分析未知杂质时，无需纯品作对照，且没有破坏性，充分发挥了其专属性强、快速、准确的优点，能做到快速分离、结构鉴定并且对样品进行定性定量分析。

4 小结

HPLC法在《中国药典》中应用范围不断扩大，充分说明了该法在药品检测领域的重要地位。在《中国药典》一部(中药)部分，HPLC法主要用于特征图谱的定性分析、指纹图谱的半定量分析以及多成分的含量测定。在《中国药典》二部(化学药品)部分，HPLC法主要用于鉴别、有关物质与含量测定，对于复杂样品体系，必要时采用固相萃取柱进行前处理和富集。在《中国药典》三部(生物制品)部分，HPLC法主要用于蛋白质结构和纯度分析。

现代HPLC法的发展将在技术革新、发展检测器、创新色谱填料技术、完善理论等方面做出努力，促使HPLC法及其相关方法在各个领域的应用范围不断扩大，进一步稳固HPLC法的主流分析地位，具有广阔的发展前景。