弥散加权成像评价大鼠复苏后脑损伤研究

刘志锋 叶浩翊 阮耀钦 伍志华 杨正飞

脑损伤是心脏骤停（cardiac arrest，CA）幸存者死亡的主要原因，随着心肺复苏（cardiopulmonary resuscitation，CPR）技术革新，死亡率逐年降低［1］。然而，仍然有超过75%的幸存者出现脑损伤而致残［2］。早期评估CA/CPR 后脑损伤及预测患者预后对临床调整治疗策略十分重要。研究［3］发现核磁共振弥散加权成像（diffusion⁃weighted magnetic resonance imaging，DWI）可以评估CA/CPR 后脑水肿预测患者预后，然而DWI 检查的最优时间点仍然没有形成共识，是否存在某一些时间点不适用于评估脑水肿？基于这一临床科学问题，我们设计了一组动物实验，建立大鼠CA 模型分别在CA/CPR 后恢复自主循环（return of spontaneous circulation，ROSC）6 及24 小时后行DWI 检查，对比分析两个检查时间点对评估CA/CPR 后脑水肿的价值，为临床提供实验性研究数据。

1 资料与方法

1.1 心脏骤停模型分组及制作 将20 只体重为（506±13）g 的雄性SD 大鼠放在无菌房间内饲养，该房间在恒温（20-22℃）下光照和黑暗均12 小时。将大鼠随机分为sham 组（n=6）、ROSC6h 组（n=7）及ROSC24 组（n=7），采用3%戊巴比妥钠腹腔注射45 mg/kg 麻醉大鼠使用自制心肺复苏参考先前研究方法制作大鼠窒息CA 模型［4］。假手术组动物进行了相同的手术，但没有诱导窒息。本研究为前瞻性对照实验研究，本研究采用的实验动物均取得广东省实验动物质量合格证明，本实验得到了广州市增城区人民医院伦理委员会的批准。

1.2 仪器与方法 所有大鼠模型扫描均使用GE 1.5T MRI 成像仪（GE 1.5T Signa HDi，美国）和横向1.5T 8 通道大鼠专用线圈（CG⁃MUC44⁃H150⁃AG，上海晨光有限公司）进行。各组大鼠均通过腹膜内注射3%戊巴比妥钠（10 mg/kg）进行麻醉，将大鼠模型固定在线圈中，保持俯卧姿势行DWI 序列横断位扫描。TR 3000 ms，TE 125 ms，矩阵128×192，FOV 80 mm×80 mm，层厚2.5 mm，层间距0.8 mm，信号激励次数8 次，采集时间1.5分钟。

1.3 各组大鼠全脑ADC 值测量 各组大鼠全脑ADC 值由两名具有5 年以上工作经验的放射科医生独立测量，并取两名测量者平均值。选择大鼠全脑（横断面经海马包括小脑及大脑的最大层面）作为感兴趣的区域（ROI）。使用GE 后处理工作站Functool 软件测量大鼠全脑ADC 值。

1.4 免疫组化方法 将大鼠断头取脑组织用4%中性缓冲甲醛固定24 小时后制作成石蜡组织块，石蜡组织以4 μm 厚切片，防脱载玻片捞片，使用MaxVisionTMHRP 免疫组织化学试剂盒进行水通道蛋白4（aquaporin⁃4，AQP4）染色，具体步骤按照试剂盒操作说明书进行。

1.5 统计方法 运用SPSS 25 软件包（SPSS，Chi⁃cago，IL）对所得数据进行分析。连续变量计量资料以（±s）表示，分类变量以百分比（%）表示，各组间的比较使用方差分析（one⁃way ANOVA），若数据方差齐时两两比较采用L⁃S⁃D 检验，方差不齐时采用Dunnett's T3 法检验。P＜0.05 认为差异具有统计学意义。

2 结 果

本研究共使用了20 只SD 雄性大鼠，14 只大鼠接受了CPR，12 只大鼠成功ROSC（12/14，85.7%）其中2 只未能ROSC（2/14，14.3%），其余6 只大鼠接受了假手术。

2.1 各组大鼠的基线特征和CPR 特征 见表1。

表1 各组大鼠基线生理参数及CPR 特征（±s）

表1 各组大鼠基线生理参数及CPR 特征（±s）

注：ROSC=return of spontaneous circulation；各组间比较P 值均＞0.05。

变量体重（g）心率（次/分钟）呼气末CO2分压（mm Hg）平均动脉压（mm Hg）动脉血pH 值氧分压（mm Hg）动脉血乳酸（mmol/L）窒息时间（分钟）心脏按压时间（分钟）sham（n=6）516±19 395±27 42±2 122±7 7.32±0.04 93±12 1.1±0.3--ROSC6h（n=6）514±21 403±30 41±3 119±14 7.41±0.05 94±13 1.2±0.4 10.3±0.9 3.8±1.2 ROSC24 h（n=6）517±20 409±28 44±3 121±11 7.39±0.03 92±14 1.2±0.3 10.8±1.1 3.9±1.7

2.2 各组大鼠的全脑DWI 分析 见图1、表2。

2.2 各组大鼠的AQP4 免疫组化分析 见图2。图2. 各组大鼠AQP4 抗体免疫组化DAB 显色（放大倍数200×）。A、sham 组大鼠神经细胞AQP4抗体表达阴性；B、ROSC6h 组神经细胞AQP4 抗体表达强阳性；C、ROSC24h 组神经细胞AQP4 抗体表达阳性。

图1 各组大鼠模型DWI 图像。Sham 组（A）、ROSC6h 组（B）及ROSC24 h 组（C）DWI 图像均未见异常信号

表2 各组大鼠全脑ADC 值比较

3 讨 论

图2 各组大鼠AQP4 抗体免疫组化DAB 显色（放大倍数200×）

CA/CPR 后的脑缺血-再灌注损伤是临床预后的主要决定因素，它的起因是由于脑氧输送的减少，引起一系列复杂的病理生理级联反应，导致血脑屏障破坏，脑代谢异常和脑水肿等［5］。在这项研究中，比较了大鼠CA/CPR 后在ROSC 6 h 和24 h的全脑ADC 值。结果表明，大鼠CA/CPR 后出现脑水肿，ADC 值在复苏早期（ROSC6h）可以评估脑水肿，但是在复苏后期（ROSC24h）评估脑水肿受限。DWI 利用水分子扩散来成像，提供基于脑生理状态的信息，可以检测并定量评估CA/CPR 后脑水肿的严重程度及预测患者神经预后［3］。Park JS 等［6］回顾分析36 例院外CA 患者6 小时内的DWI 检查，发现6 个月后神经预后不良的患者全脑ADC 值明显下降，均小于700×10-6mm2/s，结果提示CA 早期出现严重的脑细胞毒性水肿，ADC 值下降可预测患者神经预后不良。Hirsch KG 等［3］，对51 例在CA 后7 天内接受DWI 检查的患者分析，结果显示神经预后不良的患者脑部ADC ＜650×10-6mm2/s，灵敏度为63%，特异性96%，阳性预测值为94%。本研究DWI 结果显示大鼠复苏早期（ROSC6h）ADC 值明显下降，免疫组化结果显示AQP4 抗体表达强阳性，提示大鼠脑部出现严重的脑水肿，表明ADC 值在复苏早期可以评估脑水肿。随着复苏时间的推移，复苏后期（ROSC24h）大鼠脑部ADC 值回升，与sham 组比较无统计学差异，然而免疫组化结果显示复苏后期（ROSC24h）AQP4 抗体表达仍为阳性，但是表达程度较复苏早期（ROSC6h）下降，结果表明在复苏后期（ROSC24h）评估脑水肿可能受限。Tang Z 等［7］对比分析猪CA 模型ROSC6h 与72 h 的全脑ADC值，发现随着复苏时间推移出现全脑ADC 值回升的现象，与本研究结果相近。随着复苏后脑血流量的升高，大脑供血供氧恢复，短期内脑内细小血管自身调节功能逐步恢复，清除了短暂堆积的代谢物质后恢复了细胞功能所需的内环境，故细胞毒性水肿好转，ADC 值回升；另外，CA/CPR 后血液复流，造成血管内皮细胞再灌注损伤，加剧血脑屏障受损而通透性增加，大量的自由水经受损的血脑屏障从血管进入血管外细胞外间隙，导致血管源性脑水肿，血管外细胞外间隙内弥散运动快的自由水增多，导致弥散系数增加，故复苏后期（ROSC24h）ADC 值上升［8］。

本实验存在几点不足之处：第一，本实验使用健康的大鼠，不能模拟人类真实的疾病状态；第二，本研究三组大鼠样本量较少；第三，本实验只研究了ROSC6h 和24 h 两个时间点，研究更多的ROSC 时间点有利于了解CA/CPR 后脑水肿演变。综上所述，ADC 值可用于CA/CPR 后复苏早期（ROSC6h）脑水肿评估，但是在复苏后期（ROSC24h）评估脑水肿受限。

致谢

本组实验所有大鼠模型均在中山大学孙逸仙纪念医院唐万春急危重症实验室完成。在此向实验室全体工作人员表示衷心地感谢！