葵花盘霉变标志物的制备及在中药安全性评价中的应用*

刘吉爽，段连政，徐文慧，常丽静，姜柔齐，宫喜艳，邱智东，陈新

(长春中医药大学药学院，长春 130117)

葵花盘为菊科植物向日葵(HelianthusannuusL.)收取果实后的干燥花序托，为中成药玉盘消渴片组成成分之一，药材标准收载于《上海市中药材标准》(1994年版)[1]，饮片炮制规范收载于《浙江省炮制规范》(1986年版)[2]。葵花盘鲜品含水量丰富，产地加工、炮制及贮藏不当均易诱生真菌。中药成分复杂，即使除去霉变药材表面真菌，一些肉眼难以检识到的真菌依然残留其中，霉变药材一旦使用，安全性将难以保障。

国家标准、地方标准甚至国际标准对于中药(饮片)及相关制剂的霉变检查尚无完善的评价方法，现有技术主要通过肉眼、显微镜或真菌毒素检查。但并非所有霉变药材均能检出真菌毒素，某些药材(如陈皮)采用此方法不能准确判断是否霉变。针对此问题，本实验以葵花盘为研究对象，通过制备霉变标志物，并以此为对照，建立了葵花盘霉变评价方法，同时对此方法在中药安全性评价的应用进行研究，为葵花盘安全性检查及质量评价体系的完善奠定基础，为中药霉变安全性评价方法的建立提供新思路。

1 仪器与材料

1.1仪器配有DAD检测器的1260型安捷伦高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)，SY-型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。

1.2材料硅胶G薄层板(青岛海洋化工厂)，甲苯(批号：20160617，分析纯)、乙酸乙酯(批号：20180126，分析纯)、甲酸(批号：20160612，分析纯)、石油醚(批号：20170525，分析纯)、甲醇(批号：20170106，分析纯)均为北京化工厂产品。葵花盘对照药材为实验室自制，葵花盘其他样品采集于吉林省洮南市区、洮南市二龙乡等地，经长春中医药大学张景龙老师鉴定为菊科植物向日葵(HelianthusannuusL.)收取果实后的干燥花序托。霉变样品为贮藏时发霉，霉变肉眼可见。

2 方法与结果

2.1葵花盘真菌的鉴定

2.1.1黄曲霉毒素检查采用《中华人民共和国药典》(2015年版)四部液质联用检测方法分别对葵花盘未霉变及霉变样品的4种黄曲霉毒素(黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2)进行测定[3]。结果均未检测到黄曲霉毒素，葵花盘霉变与黄曲霉毒素无直接联系，所生真菌并非黄曲霉。

2.1.2真菌的鉴别取不同产地葵花盘霉变样品4份(样品因贮藏不当滋生真菌)，分别挑取真菌进行革兰染色，于显微镜下观察菌落及菌丝特征。各样品所生真菌存在一定相似之处：菌落多粗糙，带不同颜色；菌丝多分隔，且均为革兰阳性菌。结果见表1、图1。

a.样品1；b.样品2；c.样品3；d.样品4。

表1 葵花盘霉变样品真菌特征

2.2霉变标志物的研究

2.2.1葵花盘霉变前后薄层检视取霉变葵花盘样品1 g，加50倍甲醇超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL溶解。以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(24：7：1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(波长365 nm)下检视。结果葵花盘霉变前后薄层色谱斑点行为不一致，葵花盘霉变样品主斑点颜色变浅且伴随绿色荧光斑点出现。见图2。

1.对照药材；2，3.吉林省洮南市区样品；4，5.吉林省洮南市区(霉变)样品；6，7.吉林省洮南市二龙乡样品；8，9.吉林省洮南市二龙乡(霉变)样品。

2.2.2霉变相关性验证为验证绿色荧光斑点与葵花盘霉变的相关性，实验配制不同比例霉变样品，照“2.2.1”项下方法进行薄层检视。结果随霉变比例增加，样品中原存的蓝紫色斑点的荧光强度下降，绿色荧光斑点强度反之增强。见图3。

1.对照药材；2.10%霉变样品；3.20%霉变样品；4.30%霉变样品；5.40%霉变样品；6.50%霉变样品；7.100%霉变样品。

2.2.3霉变标志物的确定剥离霉变葵花盘表面真菌，照“2.2.1”项下方法制备真菌提取液、葵花盘对照药材提取液及霉变葵花盘提取液，分别吸取适量进行薄层检视。结果在与霉变药材色谱相应的位置上，真菌显单一的绿色荧光斑点，霉变样品除与真菌对应斑点外仍显其他斑点。推测葵花盘霉变所产生的绿色荧光斑点其一为真菌所致，确定该成分为霉变标志物；另一个可能为相关化学成分转化所致。见图4。

1，2.真菌；3，4.霉变药材；5.对照药材。

综上，可证明绿色荧光斑点的产生与葵花盘霉变密切相关，薄层检识出现绿色荧光斑点，即可认为样品发生一定霉变。

2.2.4霉变样品最小检出量的测定取葵花盘霉变样品0.5 g，按照“2.2.1”项下方法，考察葵花盘霉变样品最小检出量。结果显示，霉变最小检出量为4.11 μg，该方法灵敏。结果见图5，编号1～7样品斑点霉变含量依次为2630，1320，658，329，164，82，41，25，10，4，2 μg。

1-11.霉变药材。

2.2.5霉变阳性对照药材制备取不同产地的葵花盘药材2个，每个花盘分成均等2份，其中一份保留，另一份连续5 d每天喷水适量，于自封袋中密封，室温下培养真菌。约2周样品发生霉变，取霉变样品及对应药材照“2.2.1”项下方法实验。同一产地葵花盘霉变前后薄层色谱行为有明显差异；比较不同批次霉变样品的薄层色谱发现，斑点行为不一致，但与霉变标志物相比均显相同绿色荧光斑点，故确定该斑点为评价葵花盘霉变的标志。结果见图6。

1.真菌样品；2.大安市样品；3.大安市样品(霉变)；4.安广市样品；5.安广市样品(霉变)。

2.3霉变标志物的制备

2.3.1霉变样品提取、分离取霉变葵花盘样品粉末15 g，加10倍量乙酸乙酯超声提取30 min，滤过，旋干，加少量乙酸乙酯使溶解，加硅胶适量，拌匀，水浴挥干溶剂，以石油醚为溶剂湿法装柱，干法上样，依次用石油醚、石油醚：乙酸乙酯(20：1)混合溶液、石油醚：乙酸乙酯(20：2)混合溶液洗脱，用“2.2.1”项下薄层色谱法追踪霉变标志物，以石油醚：乙酸乙酯(20：2)混合溶液洗脱可检识到目标成分，收集合并洗脱液，回收溶剂，得霉变标志物的粗提物。

2.3.2霉变标志物的精制取霉变标志物粗提物适量点于薄层板，按照“2.2.1”项下方法检识，霉变标志物在紫外波长254，365 nm下均显绿色荧光，将此设置为液相检识波长。

取适量的粗提物加甲醇溶散，经孔径0.22 μm滤膜滤过，于安捷伦1260高效液相色谱仪(配有DAD检测器)进样，以乙腈：水(35：65)为流动相，柱温25 ℃，254，365 nm双波长同时检测。目标成分约39 min开始出峰，富集目标峰馏分，浓缩得葵花盘霉变标志物。见图7。

A.365 nm；B.254 nm；1.霉变标志物。

2.4霉变评价方法的建立分别取葵花盘对照药材、真菌、不同批次霉变样品，按照“2.2.1”项下方法实验。结果显示，各霉变样品薄层色谱均显与霉变标志物相同的绿色荧光斑点，该方法简便易行、灵敏度高，可作为评价葵花盘霉变的有效方法。见图8。

1-10.霉变药材；11.对照药材；12.霉变标志物。

综上，形成葵花盘霉变安全性评价方法如下：取样品粉末适量，加50倍量甲醇超声30 min，滤过，蒸干，加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。分别吸取霉变标志物溶液5 μL、供试品溶液5～10 μL点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(12：3.5：0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视，不得显与霉变标志物相同颜色斑点。

2.5方法适用性考察

2.5.1霉变药材检视①薄层检视：温度25～28 ℃，相对湿度约80%为真菌繁殖的最适条件[4]，为考察霉变安全性评价方法的适用性，收集柴胡、泽泻、葛根、升麻等12种霉变药材，照“2.4”项下方法对不同霉变药材进行实验。葛根、黄芪、黄精、槐米、陈皮、人参、知母、桔梗霉变样品均显与霉变标志物相同颜色荧光斑点，未霉变药材无此斑点；升麻、柴胡、泽泻及茯苓未霉变及霉变样品与霉变标志物相比，均显微弱荧光。结果见图9，10。

1.槐米；2.槐米(霉变)；3.黄精；4.黄精(霉变)；5.陈皮；6.陈皮(霉变)；7.人参；8.人参(霉变)；9.泽泻；10.泽泻(霉变)；11.葛根；12.葛根(霉变)；13.霉变标志物。

②成分验证：取霉变陈皮0.5 g，加30倍量乙酸乙酯超声提取30 min，滤过，滤液蒸干，用硅胶湿法装柱，干法上样，分别用石油醚、石油醚：乙酸乙酯(20：1)、石油醚：乙酸乙酯(20：2)混合溶剂洗脱，薄层色谱法追踪并收集与霉变标志物对应位置显相同荧光的洗脱液，合并洗脱液，适当浓缩，与霉变标志物同“2.3.2”项方法实验。观察霉变陈皮与霉变标志物吸收曲线，基本确定为同一类成分，三维谱图见图11，12。

1.升麻；2.升麻(霉变)；3.柴胡；4.柴胡(霉变)；5.桔梗；6.桔梗(霉变)；7.知母；8.知母(霉变)；9.黄芪；10.黄芪(霉变)；11.茯苓；12.茯苓(霉变)；13.霉变标志物。

图11 霉变标志物三维图谱

2.5.2菌类药物检视①薄层检视：茯苓为多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核[7]，霉变标志物为葵花盘霉变样品中提取，故显与霉变标志物相同斑点具有一定道理。为验证茯苓薄层结果的推断，实验分别取多孔菌科真菌猪苓、锈革孔菌科白桦茸及僵蚕(幼虫感染白僵菌而致死的干燥体)同茯苓照“2.2.1”项下方法进行实验。

结果4种菌类药物均含与霉变标志物相同斑点，提示菌类药物中可能存在某些与霉变标志物相似的成分，故该法不适于菌类药物的霉变安全性评价。见图13。

图12 霉变陈皮三维图谱

1.白桦茸；2.猪苓；3.僵蚕；4.茯苓。

②成分验证：按照“2.5.1②”项下方法对白桦茸进行实验，观察霉变标志物与白桦茸吸收曲线(图11，14)，基本确定为同一类成分。

3 讨论

中药成分复杂，贮存、运输、处理不当均易造成霉变，相关研究表明葵花盘具有丰富的营养物质，如萜类、多糖、黄酮、绿原酸等[4-8]，可广泛应用于食用菌类的培养和牲畜饲料的制备[9-12]。真菌鉴定结果表明，葵花盘所滋生的真菌并非黄曲霉，但均为革兰阳性菌。革兰阳性菌是引起多种疾病的主要致病菌，对人体健康存在潜在危害，霉变是葵花盘广泛应用的重要阻碍。

图14 白桦茸三维图谱

葵花盘的膜质托片排列紧密，对于滋生在其内部的真菌难以观察。传统的中药霉变评价方法检测灵敏度低、应用范围受限，本实验提出从霉变中药或其所生真菌中分离制备霉变标志物，建立以薄层指纹图谱技术为指导的中药霉变安全性评价新方法，所建立的霉变评价方法简便、灵敏度高，能够有效评价葵花盘的安全性。

中药的安全性评价适用性实验表明，升麻、柴胡、泽泻未霉变药材与霉变标志物薄层均显微弱荧光，推测可能为样品贮藏时间过长而滋生肉眼不易观察的真菌[13-16]。茯苓、猪苓、白桦茸本身为菌类，僵蚕为感染了白僵菌的干燥体，可能有与霉变标志物同类成分存在，故安全性评价结果呈假阳性。槐米、陈皮、人参等霉变样品的薄层色谱与霉变标志物均显相同颜色斑点，分析所含成分，均含大量的皂苷、多糖、蛋白质等[17-19]，这些成分对于微生物繁殖增长具有促进作用。该法可作为评价多糖、皂苷及蛋白质含量较高的植物中药安全性的有效手段，但不适于菌类药材，具体适用的范围有待进一步验证。

《中华人民共和国药典》2020年版编制要点指出，要进一步完善中药材安全性检测方法[20]。本实验初步研究建立了葵花盘霉变安全性评价方法，所建立方法灵敏、简便、有效，对于保证中药临床使用安全具有重要意义，为中药安全性评价研究提供新思路。课题组将进一步对霉变标志物的化学结构及毒性进行研究，并对霉变中药显相同荧光的成分进一步分析，期待日后可为《中华人民共和国药典》等行业标准的中药材安全性检查方法提供参考。