马铃薯脯氨酸转运体StProT3的序列结构及表达分析

王 明，王万兴，何长征，胡新喜，熊兴耀，秦玉芝*

（1.湖南农业大学园艺园林学院，湖南 长沙 410128；2.中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

脯氨酸是植物对逆境胁迫响应的重要生理指标[1]，植物在干旱[2]、高温、低温、盐渍等不利环境下，伴随着脯氨酸的积累。关于脯氨酸积累对植物保护作用的机制有多种说法，如作为渗透调节剂、自由基清除剂或大分子结构保护剂等来维持植物正常的代谢[3]。Kemble和Macpherson[4]发现多年生黑麦草脯氨酸的抗旱机制，在干旱胁迫下其叶片累积脯氨酸，脯氨酸的含量随着胁迫时间的延长而增多。Hadi和Fuller[5]研究表明脯氨酸含量与干旱（R2=0.524）和盐（R2=0.786）耐受性呈显著正相关。前期研究发现，细胞质和液泡中的脯氨酸的分布约为15～98∶1。盐和干旱胁迫下，脯氨酸首先在细胞质中积累，当细胞转至渗透下，液泡中的脯氨酸含量开始下降[6]。无论哪种逆境，脯氨酸在植物中的积累，可以比原始含量增加数十至数百倍。尽管不同组织或部位游离脯氨酸的变化存在差异，但其含量与其抗逆性呈正相关[7-13]，这也说明脯氨酸对植物各部位的自我保护起着重要作用。

越来越多的研究表明，脯氨酸转运体可能在脯氨酸积累过程中起重要作用。脯氨酸转运体ProT1、ProT2和ProT3相继在拟南芥中鉴定出来，其中AtProT1在全株韧皮部或韧皮部薄壁组织细胞中均有表达，说明其在相容性溶质的长距离运输中起作用[14]。在植物中，有多个氨基酸转运蛋白家族，如氨基酸通透酶家族（AAPs）、赖氨酸组氨酸转运蛋白家族（LHTs）和脯氨酸转运体家族（ProTs）参与脯氨酸在各个器官间的运输[15]。脯氨酸的合成与降解在细胞内呈区室化分布，胁迫条件下脯氨酸积累，而胁迫消除时脯氨酸迅速降解，说明细胞内脯氨酸的转运体在逆境中起重要作用。另外，脯氨酸转运体同样存在于细胞间，缺水条件下白三叶草的韧皮部出现高浓度的脯氨酸积累[16]。

农业生产中马铃薯经常遭受干旱、盐碱和极端温度等非生物胁迫，而关于马铃薯ProT家族的生物信息学分析以及非生物胁迫相关性研究尚且不多。本研究采用RT-PCR技术，从马铃薯GS393中克隆了1个ProT家族基因StProT3，对其核酸及蛋白质序列结构进行系统分析，同时研究了StProT3基因的组织表达特异性及其在不同非生物胁迫下的表达。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为马铃薯GS393（Solanumcommersonii-LZ3.4-Wisconsin，United States）。

主要试剂：植物去多糖多酚总RNA提取试剂盒和2 000 bp DNA Ladder，购自北京天根生化科技有限公司，GoldenstarTMRT6 cDNA Synthesis Kit，PCR Master Mix，2×T5 Fast qPCR Mix，pClone007 Vector及琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，购自北京擎科新业生物技术有限公司；IAA、GA3、ABA、6-BA和聚乙二醇6000（PEG-6000）购自Sigma。相关引物（表1）由北京擎科新业生物技术有限公司合成。

表1 马铃薯StProT3 PCR扩增引物序列Table 1 Primer sequences for PCR amplification of potato StProT3

1.2 方法

1.2.1 材料处理和采集

用MS固体培养基（MS液体培养基+0.7%琼脂粉+3%蔗糖，pH 5.8～6.0）培养马铃薯30 d，选择具有相同生长势的组培苗，分别进行处理。将样品包裹在锡箔纸中，在液氮中快速冷冻并储存在-80℃冰箱中备用。将组培苗用漂浮板将根部浸泡在氯化汞（200 mg/L）、氯化镉（200 mg/L）、氯化铜（200 mg/L）、氯化铝（200 mg/L）、NaCl（11.7 g/L）和PEG-6000（20 g/L）中，蒸馏水为对照；将组培苗放置霜冻箱中4℃处理；重金属和低温处理均按0，2，8，24，36和48 h取样。用IAA（100 mg/L）、GA3（100 mg/L）、ABA（100 mg/L）、6-BA（100 mg/L）喷施GS393组培苗，每瓶喷施3 mL，均按0，2，8，24和36 h取样。每组处理设置3个重复。

1.2.2 马铃薯总RNA提取及基因ORF的扩增

马铃薯总RNA提取采用植物去多糖多酚总RNA提取试剂盒，用微量紫外分光光度计测量浓度和纯度。RNA反转录用GoldenstarTMRT6 cDNA Synthesis Kit试剂盒（北京擎科新业生物技术有限公司）完成。根据实验室转录组测序所得到的StProT3的5'和3'的序列，利用Primer 5.0设计在基因StProT3的ORF起始子ATG和终止子TAA处设计特异引物。以上述反转录的cDNA为模板进行PCR。反应体系为Mix 12.5 uL，上、下游引物各1μL，cDNA 2μL，ddH2O 9.5μL。PCR扩增条件：98℃运行2 min，98℃运行30 s，55℃运行30 s，72℃运行30 s，72℃运行10 min，10℃保存。对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，切胶、回收后连接载体pClone007，并转化到大肠杆菌DH5α感受态，37℃过夜培养，经菌落PCR检测筛选阳性克隆后送至测序。

1.2.3 StProT3序列的生物信息学分析

利用DNAMAN 6.0软件，对CDS序列进行翻译和蛋白质序列多重比对，并对蛋白质分子式、等电点、疏水性和蛋白分子量等理化性质进行预测分析；通过NCBI中的Protein blast进行相似蛋白的搜索，并下载茄科植物的ProT蛋白序列；利用TMHMM判定是否为膜蛋白；利用SMART预测蛋白质的功能结构域；采用SWISS-MODLE在线预测蛋白质的三级结构；用MEGA 7.0构建氨基酸序列系统进化树；通过PlantCare对StProT3基因进行启动子调控元件分析。

1.2.4 基因表达模式分析

荧光定量仪器使用Applied Biosystems Q5型定量PCR仪，基因的相对表达量采用2-ΔΔCT公式计算，分析基因StProT3的表达情况。用Primier 5.0设计基因StProT3荧光定量引物，并以Actin作为内参对照。以上述反转录cDNA为模板，反应体系为20 uL，参照2×T5 Fast qPCR Mix荧光定量试剂盒，反应程序为95℃运行1 min，95℃运行10 s，60℃运行15 s，40个循环。每个样品均设置3个重复。

1.2.5 数据分析

利用DPS 7.05软件进行数据统计分析，采用GraphPad Prism6制图。

2 结果与分析

2.1 基因的克隆及序列分析

通过比对马铃薯转录组数据库，并以PCR验证，获得的目的基因含完整CDS序列，目的基因CDS大小为1 317 bp（图1），编码438个氨基酸，位于染色体ch05上。分子式为C2266H3449N557O578S15。生物信息学分析结果显示，该序列编码的蛋白相对分子量为48 223.60 Da，理论等电点为9.32；不稳定指数为31.56，属于稳定蛋白。脂肪指数为110.53，亲水性的平均值是0.596，属于疏水性蛋白。结构域预测分析表明，该蛋白存在12个跨膜结构域（图2），还含有2个低复杂结构，存在于57～81位氨基酸和272～285位氨基酸。用SignalP 4.1 Server预测信号肽，结果发现StProT3蛋白的S平均值为0.113，小于0.5，预测不存在信号肽。用SOPMA二级结构和SWISS-MODEL 3D结构进行预测的结果表明，StProT3蛋白主要由46.35%的α螺旋，22.60%的延伸链，4.34%的β折叠和26.71%的无规则卷曲组成（图3）。

图1 StProT3的PCR扩增产物电泳检测Figure1 Electrophoretic detection of PCR amplification productsof StProT3

图2 StProT3基因的氨基酸序列分析Figure 2 Amino acid sequence analysis of StProT3 gene

2.2 StProT3蛋白同源性分析

与茄科植物蛋白数据库比对结果表明，该蛋白与番茄（Solanum lycopersicum）ProT基因家族的SlyProT3具有96%的相似性，其次是辣椒（Capsicumannuum），一致性达92%，因此将其命名为StProT3，NCBIID注册为MH027990.1。

选择水稻、拟南芥和番茄3个物种的ProT同源蛋白序列与StProT3进行氨基酸多重序列比对。多重序列比对结果显示一致性为69.01%（图4），这些ProT蛋白的ProT结构域高度保守。系统进化树分析结果显示（图5），马铃薯StProT3与同属同科的番茄和辣椒ProT3蛋白亲缘关系最近。

2.3 基因StProT3启动子元件分析

在https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html马铃薯数据库里查找StProT3基因的启动子序列，截取起始子ATG上游区域约1 500 bp启动子序列，通过PlantCare预测表明基因StProT3在翻译起始子上游含有光响应元件Box 4、Gap-box、I-box和Sp1，低温响应元件LTR，MYB结合位点参与干旱诱导的顺式作用元件MBS，以及参与昼夜控制的顺式作用调节元件circadian。具体顺式作用元件见图6。

2.4 StProT3组织表达特异性

组织表达分析结果（图7A）（P＜0.05）表明，StProT3在马铃薯根、茎、叶、匍匐茎和块茎中皆有表达，其中，表达量最高的组织是根，茎次之，表达量最低的组织是匍匐茎。

2.5 StProT3的非生物胁迫表达分析

StProT3的重金属诱导表达分析结果显示（图7B）（P＜0.01），马铃薯中StProT3受汞胁迫诱导最大，在48 h内处在上调阶段，表达量在24 h最高。基因StProT3受Al胁迫诱导较明显，在48h是对照10.2倍。在CdCl2处理24h时，StProT3显著高于对照，为对照的4倍，48h时，该基因的表达基本恢复到与对照相近的水平。CuCl2处理2h时表达量达到最高，约为对照的25.3倍，处理24h时，该基因的表达低于对照达到最低，为对照的0.7倍，之后恢复到对照相近的水平。

图4 茄科不同物种ProT氨基酸序列的多重比对Figure4 Multiplealignment of ProT amino acid sequencesin different speciesof Solanaceae

图5 StProT3氨基酸序列与不同物种ProT氨基酸的系统进化树Figure 5 Phylogenetic tree of StProT3 amino acid sequence and ProT amino acids of different species

图6 基因StProT3启动子序列分析Figure 6 Sequence analysis of the gene StProT3 promoter

激素胁迫处理表明（图7C）（P＜0.05），在36 h内ABA抑制基因StProT3的表达，36 h时最低，是对照的0.04倍。6-BA处理24 h时，StProT3的表达显著高于对照，达到最高峰，为对照的16倍。在GA3胁迫下基因StProT3 2 h内处于上调，在2 h时表达量达到最大值，是对照的4.8倍；在8～24 h处于下调，在24 h时表达量达到最小值为对照的0.1倍。在IAA处理下，8 h时基因的表达量达到最高，约为对照的7.1倍。

图7D结果显示（P＜0.01），StProT3的表达受低温抑制，但受盐胁迫和干旱胁迫的诱导。在4℃低温胁迫下，8 h时表达量达到最低，约为对照的0.05倍。NaCl处理8 h时，StProT3的表达显著高于对照。PEG-6000处理48 h内基因StProT3的表达一直处于上调水平，48 h仍显著高于对照。

3 讨论

StProT3在马铃薯的根、茎、叶、匍匐茎和块茎中的相对表达量差异显著，在根中的相对表达量明显高于其他组织，推测马铃薯根部形态建成可能与StProT参与有关。Shen等[17]在榆钱菠菜中克隆的AhProT1基因在拟南芥和番茄中表达的ProT氨基酸序列均含有11个核心跨膜结构域（cTM），都是高度保守区，这与前人的研究相一致；Akihiro等[18]在盐胁迫下也发现HvProT基因在大麦的根尖部强烈表达，这与前人的研究相一致。说明ProT家族蛋白具有分布广和功能多的性质，其家族基因在植物生长和发育中起重要作用。

图7 StProT3基因在马铃薯不同组织和非生物胁迫中的相对表达量Figure 7 Relative expression of StProT3 gene in different tissues and under abiotic stresses of potato

本研究的马铃薯被氯化汞、氯化镉、氯化铜、氯化铝、PEG-6000、NaCl、IAA、GA3、6-BA处理能诱导StProT3基因表达，而被低温和ABA处理则抑制表达，表明StProT3基因参与了马铃薯的激素信号传导以及非生物胁迫响应。对StProT的胁迫表达模式研究表明，StProT3基因在盐胁迫、镉胁迫、铜胁迫和IAA胁迫的表达量呈升-降的趋势，推测该基因表达存在反馈调控。Liu和Bush[19]的结果表明，在StProT3和AtProT2启动子中有1个重要的干旱响应元件（DRE）。在干旱时拟南芥为适应环境AtProT2基因表达上调[2]，也有文献记载马铃薯在干旱渗透胁迫下显示出较强的适应能力，短时间内脯氨酸达到对照的300倍左右[20]。另外，在铝胁迫和GA3胁迫下出现的趋势是“升-降-升”，可能在受到胁迫时，脯氨酸蛋白维持在较高水平，使该基因转录受反馈机制调节。重金属胁迫下，StProT3对汞胁迫的响应最剧烈，高达对照的439倍，说明ProT3对汞胁迫更敏感。而在低温下，StProT3基因的表达量下调，结合其启动子上LTR元件说明了该基因具有响应低温的特性，调控机制还有待探索。以上印证了ProT基因存在马铃薯植物各组织中，而表达水平受渗透胁迫诱导[21]。越来越多的证据表明，植物氨基酸转运蛋白基因受到多种环境和发育信号的转录调控[22]。

诸多研究表明脯氨酸转运体基因是植物体内脯氨酸转运、调配的功能基因[11,16,17,23]。本研究发现，StProT基因在应对低温、盐、干旱、重金属胁迫和激素处理等非生物胁迫方面起了重要作用，为进一步研究马铃薯StProT蛋白家族的生物学功能和机制奠定了基础。