Hsa-miR-29c-5p 在卵巢透明细胞癌中的表达及对细胞增殖迁移的影响

邓梦琪 张艳芹 常翔宇 吴 迪 徐春玉 苗劲蔚

首都医科大学附属北京妇产医院妇瘤科，北京 100006

microRNA（miRNA）是一类特殊的非编码RNA，长约21～23 个核苷酸，通过与靶基因核糖核酸（mRNA）的3’-非编码区（3’-UTR）互补配对结合，在转录后水平修饰靶基因，从而调控基因表达[1-3]。近年来，miR-29 家族在多种肿瘤中起着重要的作用，miR-29c-3p 可以调控多种致癌过程，包括表观遗传学、蛋白质稳态、代谢、增殖、凋亡、转移、纤维化、血管生成和免疫调节[4-5]。目前对于同家族的Hsa-miR-29c-5p的研究处于初级阶段，仅在食管癌[6]、胆囊癌[7]等中探讨其作为抑癌基因并影响肿瘤发展进程的可能性。卵巢透明细胞癌（ovarian clear cell carcinoma，OCCC）属于卵巢上皮恶性肿瘤，其特性是起病隐匿、进展迅速、复发率高[8-11]。此外，透明细胞癌在早期表现为频繁转移至淋巴结和实质器官中，导致高度复发[12-14]。但在OCCC 中，Hsa-miR-29c-5p 相关报道较为罕见。基于此，本研究通过生物信息学方法分析Hsa-miR-29c-5p 在OCCC 细胞株中的表达情况及对细胞增殖、迁移活性的影响，旨在为OCCC 的治疗及预后提供新的切入点。

1 材料与方法

1.1 主要材料、试剂和设备

1.1.1 细胞株 人正常卵巢上皮细胞株（IOSE80）购自上海慧颖生物科技有限公司，人OCCC 细胞株（ES-2）购自武汉普诺赛公司。

1.1.2 主要实验试剂及材料RPMI-1 640 培养基（31800）、McCoy-s-5-A 培养基（M9420）、1XPBS 溶液（P1020）、RIPA 裂解液（R0010）、CCK-8 试剂盒（CA1210）均购自索莱宝生物科技有限公司；RNA 提取试剂盒（CW0627S）购自康为世纪；qRT-PCR 引物（MQP-0101）、qRTPCR 试剂盒（C10511-1）、Hsa-miR-29c-5p mimics（miR1190416032503）及miR-NC（miR1N0000001-1-5）均购自广州锐博有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、传代及Hsa-miR-29c 转染将IOSE80置入RPMI-1 640 培养基（含10%胎牛血清）中，ES-2置入含10%胎牛血清的McCoy-s-5-A 培养基中，于37℃、5%CO2的环境下培养，每48～72 小时更换培养液，待细胞汇合度达到80%时进行细胞传代。Hsa-miR-29c 转染：取对数生长期的ES-2 细胞接种于6 孔板中，每孔约5×105个，于37℃、5%CO2环境培养24 h。待细胞汇合度为30%～50%时，转染组加入100 nmol的Hsa-miR-29c-5p mimics，对照组加入100 nmol 的miR-NC。

1.2.2 细胞转染效率测定 取5×106～10×106个ES-2细胞加入1 mL 的TRIzol 试剂进行裂解，反复吹打，10 min 后再加入2000 μL 氯仿，手动振荡15 s后在室温下静置10 min，于4°C，12 000 g 离心20 min 后取上层清液，加入等体积异丙醇，均匀混合后同等条件下再次离心，收集下层沉淀，按照每1 mL TRIzol 加入1 mL 75%乙醇洗涤，再于同等条件下离心1 min 后晾干，再加入无RNA 酶水溶解沉淀。然后用酶标仪测定总RNA 浓度，并参照逆转录试剂盒（锐博）的说明书将总RNA 合成cDNA，于-80°C 保存。循环参数如下：①预变性95°C 持续30 s；②95°C 持续5 s，然后60°C 持续30 s，循环40 次；③95°C 持续15 s，然后60°C 持续30 s，再95°C 持续15 s。再参照qRT-PCR试剂盒说明书进行PCR 反应，测定Hsa-miR-29c-5p及内参基因U6 的miRNA 表达情况。Hsa-miR-29c-5p 上游引物为5’-TAGCAC-CATTTGAAAT-3’，下游引物为5’-GTGCAGGGTCC-GAGGT-3’；内参基因U6 上游引物为5’-CTCGCTT-CGGCAGCACA-3’，下游引物为5’-AACGCTTCAC-GAATTTGCGT-3’。最终计算ΔΔ 循环数（Ct）=（Ct转染组目的基因-Ct内参基因）-（Ct对照组目的基因-Ct内参基因）。

1.2.3 CCK-8 法 取对数生长期ES-2 分别接种于96 板孔中（细胞密度为5×104个/mL），水套式37°C 恒温培养箱（美国Thermo Fisher Scientific 公司）培养24 h，转染组加入含100 nmol Hsa-miR-29c-5p mimics 的McCoy-s-5-A 培养基，对照组加入100 nmol miR-NC的McCoy-s-5-A 培养基。于转染后24、48、72、96 h分别向每孔加入10 μL CCK-8 溶液，用Cytation 3 酶标仪（美国BioTek 公司）检测450 mm 波长处每孔的吸光度值。

1.2.4 划痕实验 在6 孔板中每孔加入约5×105个ES-2 细胞，分为转染组和对照组。24 h 后用移液枪枪头垂直于板面做出划痕，并用磷酸盐缓冲液洗细胞3 次，去除划下的细胞，转染组加入含100 nmol HsamiR-29c-5p mimics 的无血清培养基，对照组加入含100 nmol miR-NC 的无血清培养基。放入37℃，5%CO2培养箱培养，于转染48 h 后取样拍照。采用Image J 计算划痕面积。

1.3 统计学方法

采用SPSS 26.0 对所得数据进行统计学分析，计量资料组间比较采用t 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IOSE80 与ES-2 内Hsa-miR-29c-5p 的表达水平比较

qRT-PCR 检测结果表明，ES-2 内Hsa-miR-29c-5p 的表达水平低于IOSE80，差异有高度统计学意义（P ＜0.05）。见图1。

图1 IOSE80 与ES-2 中Hsa-miR-29c-5p 表达水平比较

2.2 转染组与对照组转染结果比较

转染48 h 后，在荧光显微镜下观察可见两组均有均匀明亮的红色荧光，表明Hsa-miR-29c-5p mimics及miR-NC 均转染进入细胞，见图2。qRTPCR 检测结果显示，转染组Hsa-miR-29c 的表达水平高于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05），见图3。

图2 荧光显微镜检测两组转染情况(100×)

图3 两组转染结果比较

2.3 Hsa-miR-29c-5p 对ES-2 细胞增殖及迁移的影响

CCK-8 检测结果显示，转染组转染72、96 h 后的增殖速率低与同一时间点的对照组，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。见图4。划痕实验结果显示，转染组转染48 h 后ES-2 细胞的横向迁移能力被抑制。见图5。转染48 h 后，转染组划痕面积大于对照组，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。见图6。

与同一时间点对照组比较，**P ＜0.01

图5 划痕实验检测结果（100×）

图6 转染48 h 后两组划痕面积比较

3 讨论

近年来研究发现，miRNAs 通过多个靶向转录本，参与多种与多个细胞过程相关的恶性行为[18-20]，并且在肿瘤相关变化（包括细胞增殖，细胞周期，细胞分化、凋亡和转移）中发挥着非常重要的作用[21]。有研究表明，胆囊癌中Hsa-miR-29c-5p 通过使MAPK/ERK通路失活而参与细胞凋亡，进而激活caspase 9/caspase 3/PARP 通路[22]。

OCCC 肿瘤大多为囊实性，直径为3～30 cm。其典型组织学特征表现为管状、囊状、乳头状和实性结构，瘤细胞最常见为透明细胞或呈鞋钉样。OCCC 平均发病年龄为55 岁，比浆液性癌发病年龄提前了5～6 年[23]。OCCC 作为病理形态、分子生物学及临床特征特殊的一类肿瘤逐渐成为人们关注的焦点。本研究通过siRNA 转染法成功过表达ES-2 的Hsa-miR-29c-5p，并进一步验证了转染效率。CCK-8 实验及划痕实验结果表明，转染组增殖能力及细胞迁移能力显著低于同种细胞的对照组，这提示过表达Hsa-miR-29c-5p可抑制ES-2 细胞的增殖及迁移，Hsa-miR-29c-5p有望成为OCCC 新的诊治靶点。