呼吸系统疾病生物样本采集保藏管理技术标准和规范

国家呼吸系统疾病临床医学研究中心生物样本库专家组

生物样本作为基础及临床研究的宝贵资源，对推进临床诊疗能力、提高精准医学研究水平都具有重要的现实意义[1]。我国呼吸系统疾病生物资源库建设尚处于初级阶段，普遍缺乏标准化操作流程[2]。除通用样本，例如血液、尿液、手术病理组织外，呼吸系统疾病特有样本还包括痰液（包括诱导痰）、胸腔积液、支气管肺泡灌洗液（BALF）、咽拭子浸液、支气管黏膜活检组织以及针刺活检组织等。同时，还应注意感染性疾病样本具有传染性。因此，样本采集和保藏时应区别对待，并遵循相应标准操作规程。本文重点阐述呼吸系统疾病生物样本采集、保藏、管理技术标准和规程。

1 标准操作规程

生物样本采集保藏应遵循的流程[3]：①知情同意。②登记临床信息，打印条码。③采集样本。④入库前处理。⑤入库登记。⑥入库储存。⑦管理、质控。⑧申请出库、科学研究。

1.1 血液样本采集和保藏

1.1.1 准备

运输箱、采血针，真空采血管。常用采血容器用途见表1。

表1 常用采血管用途

1.1.2 采集

抗凝管、非抗凝管各1 管（5 mL）。

1.1.3 处理

1.1.3.1 血浆 ①分离：离心力815 g，10 min，4℃。②提取：取上清液。③二次离心：离心力2500 g，10 min，4℃。④分装：取上清液[4]。

1.1.3.2 血清 ①凝血：30 min，室温。②离心：离心力1500 g，10 min，4℃。③分装：取上清液[4]。

1.1.3.3 血凝块 ①分离：分离血清。②混匀：无菌玻璃棒混匀。③分装：2 支冻存管（血凝块体积1 cm3）[5]。

1.1.3.4 白细胞 ①分离：a）预热：淋巴细胞分离液、RPMI1640 培养液至室温。b）提取：加入RPMI1640（1∶1）。c）铺血：加入淋巴细胞分离液（3 mL）。d）离心：离心力450 g，30 min，室温。e）吸取：白膜至5 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）离心管。f）离心和洗涤：离心力450 g，1 min，室温；弃上清液，加入5 mL PBS 再次洗涤、离心。②程控降温仪处理：a）混匀：弃上清液，加冻存剂保护液3 mL。b）分装：3 支冻存管中（每支1 mL）。c）降温：每分钟降1℃，直至-80℃。或RNAlater 处理：a）混匀：弃上清液，加入3 mL RNAlater。b）分装：3 支冻存管中（每支1 mL）。c）过夜：置4℃冰箱。见图1。③注意事项：a）处理时间＜1 h。b）离心机自然降速。c）无菌操作。d）冻存剂保护液预先配置并冷冻，后续置于冰上操作[6]。

图1 白细胞处理流程图

1.1.4 保藏

①全血：-80℃。②血清、血浆：液氮气相或-80℃。③血凝块：-80℃。④白细胞：-80℃[6]。血液标本采集和保藏流程见图2。

图2 血液标本采集及保藏流程图

1.2 尿液样本收集和保藏

1.2.1 准备

清洁外阴；使用合格容器。

1.2.2 收集

按要求收取样本[7]（表2），具体流程见图3。

表2 常用尿液样本种类

图3 尿液样本采集和保藏

1.2.3 处理

立即送检，不能立即可置于2～8℃保存。

1.2.4 保藏

①短期：4℃冰箱。②长期：含防腐剂容器，-20℃冰箱[8]。防腐剂添加见表3。

表3 尿液样本防腐剂添加

1.2.5 注意事项

①晨尿为宜。②婴幼儿可用黏附剂收集袋。③容器材质透明、稳定。④注明标记。⑤避免污染。⑥运输、保藏需避光。

1.3 痰液样本采集和保藏

1.3.1 准备和采集

①询问症状及肺功能。②沙丁胺醇气雾剂：适用于一秒用力呼气容积（FEV1）60%～80%，且无气促者，雾化前10 min，400 μg。③高渗盐水雾化：单一浓度法（3%或4.5%）或梯度浓度法（3%、4%、5%）；雾化10 min后漱口、擤鼻、咳嗽；FEV1＜60%或存在气促无需雾化[9]。

1.3.2 处理

1.3.2.1 痰上清液 ①采集：痰栓。②称重。③孵育：加入8 体积杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS）。④涡旋：15 s，冰上孵育15 min。⑤离心：790 g，4℃，10 min。⑥分装：取上清液，等分。

1.3.2.2 细胞涂片 ①采集并称重。②孵育：加入4 体积的0.1%二硫苏糖醇，涡旋15 s，冰上孵育15 min。③过滤：300 目滤布。④灌板计数：台盼蓝染色方法计数。⑤离心：790 g，4℃，10 min。⑥制片：涂片2 张，室温风干，甲醛固定。

1.3.2.3 细胞团块 ①混合：细胞悬液1 mL 转移至含2 mL 核糖核酸酶微量离心管。②离心：400 g，4℃，5 min，弃上清液。③悬浮：500 μL RNAlater 细胞试剂悬浮细胞团块[9]。

1.3.3 转运及保藏

①痰上清液、细胞团块：“干冰”低温运送，-80℃下储存。②细胞涂片或细胞离心涂片：室温下运送、储存。见图4。

图4 诱导痰/痰留取、处理、保藏流程图

1.3.4 注意事项

如未能及时处理，样本置于4℃，放置时间＜2 h。

1.4 组织病理（含支气管黏膜及TBNA）样本采集和保藏

1.4.1 组织样本处理

1.4.1.1 准备及采集 ①清洗。②取材：病变及对照组织。③切割：根据需要，选择快速冰冻、RNAlater 保存、石蜡包埋和最佳切割温度（OCT）包埋等中一至数种。④记录：病理诊断和处理方法。

1.4.1.2 处理方法 ①快速冰冻：处理流程参见《组织样本快速冰冻》[10]。②RNAlater 处理：处理流程参见《组织样本RNAlater 处理》[10]。③OCT 包埋：处理流程参见《组织样本OCT 包埋及冰冻切片制作》[10]。④石蜡包埋：处理流程参见《组织样本石蜡包埋及石蜡切片》[10]。

1.4.2 组织样本保藏

①快速冰冻：冻存管，液氮气相环境。②OCT 包埋：冻存管，-80℃。③冰冻切片：切片盒，-20℃。④石蜡包埋：干燥、室温。⑤石蜡切片：切片盒，干燥、室温[10]。采集与储存流程见图5。

图5 组织病理样本采集和保藏流程

1.5 BALF 样本采集和保藏

1.5.1 准备

①评估操作风险。②预热灌洗液（蒸馏灭菌水，37℃）。③样本罐置于冰上。

1.5.2 采集

①部位：病变段，弥漫性病变选择右肺中叶或左上肺舌段。②灌洗量：每次25～50 mL，总量60～120 mL。③回收：50～100 mmHg 负压吸引，回收率≥30%。④过滤：回收液置于冰上。双层无菌纱布过滤，装入灭菌容器，记录总量[11]。操作流程见图6。

图6 肺泡灌洗液留取、处理、保藏流程图

1.5.3 处理

1.5.3.1 BALF 上清 ①转移：10～15 mL 至离心管，剩余液体转移至50 mL 管。②离心：1000 g，4℃，5 min。③提取：留取上清液。④储存：保留为10×1 mL 等份和1×50 mL，标注。

1.5.3.2 沉渣涂片 ①提取：离心所得细胞沉淀。②混匀：添加生理盐水，混匀。③离心：转移60 μL 细胞悬液至4 个细胞离心涂片机每一个的漏斗，1000 g，5 min，4℃。④调整：显微镜下调整浓度。⑤制片：染色2 片；另外2 玻片完成第一步固定。使用Shandon 差异-快速试剂盒[11]。

1.5.4 保藏

①上清液：-80℃。②细胞涂片或离心涂片：室温[12]。

1.5.5 注意事项

①内镜顶端紧密楔入支气管开口。②麻醉充分。③无菌操作。④大气道病变，第一管回收液单独处理，非大气道疾病可混合后分送。

1.6 胸腔积液样本采集和保藏

1.6.1 采集

按诊疗常规胸腔穿刺留取[13]。

1.6.2 处理

①第一管微生物培养，第二管常规检查，第三管生化检查，第四、五管样本储存。②如不能送检可加入乙醇固定，病理和细胞学检查采用EDTA 盐抗凝，化学检查采用肝素抗凝。③无菌操作[14]。

1.6.3 保藏

①-40℃或-80℃冰箱。②冻融后不能再次入库。③每3 个月抽样检测[14]。采集与储存流程见图7。

图7 胸腔积液留取、处理、保藏流程图

1.7 鼻咽拭子样本采集及保藏

1.7.1 准备

评估口鼻咽或口咽部情况。

1.7.2 采集

1.7.2.1 咽拭子 无菌拭子左右两面及拭子头部刮取扁桃腺两侧及咽后壁的分泌物[15]。

1.7.2.2 鼻拭子 无菌拭子以垂直面部的方向轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留15～30 s，轻轻旋转3 次，缓慢退出[16]。

1.7.3 处理

①拭子头部折断后置于装有病毒运送液的螺口塑料试管。②试管口及棉签塞火焰上消毒后旋紧。③摇动试管，混匀。

1.7.4 转运

4℃环境。

1.7.5 保藏

①储存＜48 h：4℃冰箱。②储存＞48 h：-70～-80℃冰箱。

1.7.6 注意事项

①进食2 h 内勿采集。②样本容器无菌、干燥。③真菌培养须采集溃疡表面分泌物。

1.8 唾液样本采集及保藏

1.8.1 准备

①禁食1 h。②清水漱口。③漱口后等待10 min。④牙龈或口腔出血不宜留取。

1.8.2 采集

1.8.2.1 混合性唾液 ①弃去最初唾液，留取后续唾液2 mL。②舌下放置干燥脱脂纱布，10 min 后取出，挤出唾液备用[17]。③商业用唾液收集管（遵循相关说明书）。

1.8.2.2 单一腺体唾液 ①腮腺唾液：口腔科医生采集。②颌下腺唾液：塑料吸盘固定于舌下腺区收集[17]。

1.8.3 处理

①-20℃冰箱。②4℃环境中≤2 h。

1.8.4 保藏

＞6 个月，-80℃[17]。

1.9 高致病性样本采集和保藏

1.9.1 样本采集

①呼吸道：72 h 内采集。②血液：急性期尽快收集，恢复期在发热后3 周内收集。③尿液：置于无菌密闭容器，安全加盖并封以石蜡。④胸腔积液：置于无菌塑料螺口管。⑤肺组织活检：在超声或X 线定位下，经皮穿刺取肺组织活检样本，置于含3 mL 采样液的塑料螺口管中。

1.9.2 样本包装

①生物安全Ⅱ级实验室生物安全柜内分装成一式三份：一份当地检测用，一份送第三方检测，一份储存以备复核[18]。②每件塑料袋密封一份样本。③填写“疑似人感染高致病性疾病/不明原因肺部感染样本送检单”，用塑料袋密封。④注意事项：a）收集容器带螺旋盖，内有垫圈、耐冷冻，密封性好。b）样本外泄需立刻用消毒毛巾擦拭，后用安尔碘消毒液反复擦拭5 遍以上。c）采集者需Ⅱ级以上防护；如防护用品受污染，应立即更换。d）所有样本均需注明姓名、床号、ID 号及收集日期。e）长途转运需4℃保存。f）一次性采集器械用后即焚烧销毁[19]。

1.9.3 样本保藏

①24 h 内置于4℃保存；24 h 内无法检测置于-70℃或以下储存；如无-70℃储存条件，则于-20℃储存。②血清4℃保存3 d、-20℃以下长期储存。③储存地点应符合传染病规范，设立专库或专柜单独储存[20]。采集及保藏流程见图8。

图8 高致病性样本留取、处理、保藏流程图

2 样本入库管理规程

2.1 目的

规范储存管理，保证储存质量。

2.2 适用范围

长期储存样本。

2.3 人员职责

负责样本入库，对储存容器和设备进行监督管理。

2.4 设备要求

①室内温度、湿度。②氧含量监测报警装置。③照明调节设施。④消防设施。⑤应急电路。⑥门禁系统。⑦紧急处置预案。⑧紧急联系人名单[21]。

2.5 入库任务

①样本质量控制。②确保样本位置唯一性和可溯源性。③实时反映样本位置信息。

3 在库样本管理和质量控制

3.1 目的

正确、安全地储存样本。

3.2 适用范围

保证样本储存质量，确保样本储存位置正确。

3.3 人员职责

核实库存，确保信息正确。

3.4 库存核实

①至少一年一次。②随机选取至少1‰新入库样本量。③安全储入控制措施。④安全防护措施。⑤避免样本损耗。⑥核实后样本归位。⑦记录结果。⑧更正错误信息及数据。⑨记录纠错措施，填写分析报告[21]。

3.5 冷链系统管理和维护

冷链由基础设施、储存设备、冻存耗材、监控设备等构成[22]。

3.5.1 基础设施

①冰箱与液氮设备分开放置。②冰箱背靠墙，或间隔15 cm 以上背对背摆放。③配置备用电源。④重要样本需备份，并分开放置。

3.5.2 储存设备

①-80℃储存设备（超低温冰箱）。②-140℃储存设备（液氮气相）：需备液氮自动检测设备和自动加注设备。③-196℃储存设备（液相液氮罐和液氮储存箱）。

3.5.3 监控设备

包括冰箱温度探头、冰箱运行温度记录，液氮容器液位监控、远程报警、视频监控等。

3.5.4 冻存耗材

建议使用带有螺纹密封的冻存管，外旋冻存管适用于超低温冰箱，内旋冻存管适用于液氮气相或深冷冰箱。

4 样本出库管理规程

4.1 目的

确保样本及其信息的出库符合规定。

4.2 需用材料

液氮、干冰、样本盒、手套。

4.3 参与人员

资源库技术员、管理员、样本用户。

4.4 所需条件

①提交申请。②审核批复。③签署协议。④信息跟踪。⑤信息隐私化。

4.5 审批程序

①申请方提出申请，管理方登记“发放单”。②申请批准后，管理方批准“发放单”。③管理方查询样本加入“发放单”。④管理方移交样本。⑤申请方签收，管理方确认“发放单”。

5 样本运输标准操作规程

5.1 样本运输程序

发货方与收货方书面确认：①发货通知单。②发货清单。③物流跟踪。④收样确认。⑤审查包装测试报告。⑥送样测试。

5.2 样本运输条件

5.2.1 法规要求

①符合国际、国内法规。②参与运送员工具备资质。

5.2.2 环境要求

①温度要求：a）20～30℃：隔热包装。b）2～8℃：冰块或凝胶袋（-15℃）。c）-20℃：冷冻凝胶袋（-20℃或-20℃以下）。d）-70℃：干冰颗粒、干冰块、干冰片。包装贴上危险物品标识符。e）≤-150℃：干燥液氮罐运输。②湿度要求：湿度敏感样本，需加入干燥剂。③时间要求：交由具备资质的快递公司。④数量要求：分为多个小包装运输，备充足冷冻剂[23]。

5.2.3 注意事项

①样本置于冷冻剂间。②剩余空间用塑料泡沫填充。③清除残留标签。④运输容器定期消毒。⑤空运单不可重复使用。

5.3 国际运输

①了解接收国家法律、法规。②预估运输时间。③雇佣有资质货代公司或快递公司。④遭遇延误，可委托快递公司补充冷冻剂。

6 样本销毁管理

包括生物样本和相应材料的销毁，销毁样本符合法律法规要求[24]。

6.1 申请销毁

①提出申请，附销毁质检报告，第三方随机抽检复核。②申请批准后，由第三方销毁。

6.2 实施销毁

①核对待销毁样本。②将样本连同容器放入防生物危害销毁袋，移交第三方。③记录销毁原因、批准和执行时间及执行人员。④删除样本数据，保留知情同意撤销申请和样本销毁记录。

7 科学研究

样本使用要做到资源共享，物尽其用；科学研究后样本如有剩余，对于可反复使用的样本，在确保未被污染及可再用情况下，应运回资源库再次入库；对于不可反复使用的样本，不能再次入库。

执笔：丁永杰，罗文婷，李庆云，郑劲平。

专家组成员（按姓氏拼音排列）：丁永杰（上海交通大学医学院附属瑞金医院，上海交通大学医学院呼吸病研究所），顾文超（上海市浦东新区人民医院），郝创利（苏州大学附属儿童医院），黄树栋（阳江市人民医院），李国平（成都市第三人民医院），李庆云（上海交通大学医学院附属瑞金医院，上海交通大学医学院呼吸病研究所），李雪琴（山西晋城无烟煤矿业集团有限责任公司总医院），刘恩梅（重庆医科大学附属儿童医院），刘光辉（武汉大学中南医院），刘清华（梅州市人民医院），卢震辉（宁夏医科大学总医院），罗文婷（广州医科大学附属第一医院，国家呼吸系统疾病临床医学研究中心），邱晨（深圳市人民医院），任蕾（上海市第四康复医院），荣光生（合肥市第三人民医院），孙云（银川市妇幼保健院），田东波（广州医科大学附属第六医院），王琪（大连医科大学附属第二医院），魏春华（潍坊卫恩医院），魏立平（广州医科大学附属第三医院），余咏梅（昆明医科大学附属第一医院），张宏（甘肃省人民医院），张淇钏（汕头市中心医院），张蓉芳（甘肃省妇幼保健院），张玉焱（惠阳三和医院），赵冰融（中南大学湘雅医院），郑劲平（广州医科大学附属第一医院，国家呼吸系统疾病临床医学研究中心），郑智远（中南大学湘雅医院）。