基于HPLC-Q-TOF-MS/MS的分子网络技术快速分析夏天无生物碱

黄飞飞，王 荣，陈 玥，沈爱金， 刘艳芳，梁鑫淼，金红利，阎 松

(1.大连交通大学环境与化学工程学院，辽宁 大连 116028； 2.中国科学院大连化学物理研究所分离分析重点实验室，辽宁 大连 116023)

夏天无为罂粟科(Papaveraceae)紫堇属植物伏生紫堇Corydalisdecumbens(Thunb.) Pers.的干燥块茎，又名一粒金丹、洞里神仙、伏地延胡索等，广泛分布于湖南、江西、福建、安徽、浙江等省份[1]，是一种民间常用草药，常用于治疗高血压、中风偏瘫，跌扑损伤。研究表明，夏天无的主要有效成分是生物碱，具有抗炎、抗心律失常、改善视力、镇痛等作用，临床上对脑梗塞、风湿性关节炎、坐骨神经痛等有确切疗效[2]。目前，国内外学者已经从夏天无块茎中分离出约40个生物碱[3-5]，均为异喹啉类生物碱，包括原小檗碱类、四氢原小檗碱类、普罗托品类、阿朴啡类、苄基异喹啉类和苯酞异喹啉类等，但尚未见对夏天无提物中生物碱的系统性鉴定研究。

目前，对夏天无中化学成分的研究仅限于传统的分离手段和半制备色谱法等。液相色谱-质谱(LC-MS)法与传统方法相比，具有高分辨、高灵敏度，适用于检测未知化合物等优点。但是，由于每个化合物信号都会产生一张谱图，1次进样可产生上千乃至上万张谱图，给人工解谱带来困难。分子网络技术(molecular networking, MN)可以直观地观测到测试样品中所有能够检测到的化合物分子离子，具有类似构造的天然产物分子在相同的质谱分离条件下会产生相似的质谱碎片离子，计算机根据系统的算法对二级质谱碎片进行相似度计算，并依据相似度的高低，整合为一种可视化的网络图谱[6-7]，该技术对于不同平台的质谱仪器产生的质谱数据具有较大的兼容性。

基于LC-MS/MS数据的分子网络技术在天然产物研究领域的应用受到广泛关注，但在中药领域的研究报道却十分有限。Paz等[8]采用高效液相色谱-高分辨质谱(HPLC-HRESI MS/MS)技术和基于分子网络的分析指导，排除24个已知化合物，从苏里南杜氏藻(Duguetiasurinamensis)中分离出11个新生物碱，包括2个新骨架化合物。de Oliveira 等[9]基于碰撞诱导解离模式的液相色谱-串联质谱(LC-CID MS/MS)与分子网络联合使用，从马西米兰帝王腺萼(Adenocalymmaimperatoris-maximilianii)提取物中鉴定出63个化合物，主要为黄酮苷类，还首次鉴定到含异戊二烯基的黄酮衍生物。

本研究拟采用基于高效液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱(HPLC-Q-TOF-MS/MS)的分子网络技术，通过将碎片离子可视化，清晰地展现碎片离子的聚集与分布，直观地寻找各分子之间的相互联系，加快鉴定夏天无中的化学成分，希望为后期分离纯化和阐明药效物质基础提供依据。

1 实验部分

1.1 仪器与装置

Agilent 1290 infinity高效液相色谱仪、6540 UHD Accurate-Mass Q-TOF质谱仪：美国Agilent公司产品，配有电喷雾离子源(ESI)；MS204TS电子分析天平：美国梅特勒-托利多有限公司产品；KQ5200DE型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司产品；Milli-Q Reference超纯水系统：美国Millipore公司产品。

1.2 材料与试剂

夏天无：产自湖南，安国市同德中药材有限公司产品，经大连化物所高级工程师杨小平鉴定为Corydalisdecumbens(Thunb.) Pers.的干燥块茎；小檗碱、四氢巴马汀、原阿片碱标准品：上海源叶生物科技有限公司产品；比枯枯灵：上海吉至生化科技有限公司产品；乙腈、甲酸：美国Sigma-Aldrich公司产品；甲醇：德国Merck公司产品；实验所用试剂及超纯水均为质谱级。

1.3 实验方法

1.3.1样品溶液的制备 取约2 g夏天无药材粉末，过3号筛，置于具塞锥形瓶中，精密加入50 mL 75%甲醇，称定质量，超声60 min，放冷，再称定质量，用75%甲醇补足损失的质量，摇匀，滤液过0.22 μm微孔滤膜，待用。

1.3.2对照品溶液的制备 称取适量的小檗碱、四氢巴马汀、原阿片碱和比枯枯灵对照品，加入适量的甲醇，超声溶解，于4 ℃避光保存。

1.4 实验条件

1.4.1色谱条件 色谱柱：Waters-Acchrom-Tnature C18柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)；流动相：A为乙腈，B为0.5%甲酸水溶液；洗脱条件：0～10 min(5%～10%A)，10～50 min(10%～20%A)，50～55 min(20%～50%A)，55～70 min(50%～90%A)；流速1 mL/min；检测波长280 nm；进样量10 μL；柱温30 ℃。

1.4.2质谱条件 ESI离子源，正离子模式，气帘气压强2.41×105Pa，雾化气压强3.45×107Pa，干燥气压强3.45×107Pa，雾化温度350 ℃，干燥气流速8 L/min，离子化压力3 500 V，质量扫描范围m/z50～1 200，裂解电压75 V，碰撞能40 eV。

1.4.3GNPS分子网络分析条件 分子网络技术既可在线通过GNPS平台得到，也可离线通过软件Cytoscape得到[10]。1) 使用ReifycsAbfConventor软件(https:∥www.reifycs.com/AbfConverter/)将原始的LC-MS/MS数据转换为AnalysisBaseFile(abf)格式；2) 将转换格式后的数据通过MS-DIAL (http:∥prime.psc.riken.jp/Metabolomics_Software/MS-DIAL/)处理，MS/MS阈值设置为10，MS1和MS2质量偏差分别设置为0.01、0.025 u；3) 将MS-DIAL生成的特征量化表(txt文件)和MS/MS光谱(mgf文件)上传至GNPS(http:∥gnps.ucsd.edu)生成分子网络，余弦分数阈值设置为0.7，最小匹配碎片离子为6，topK设置为10，母离子之间的最大质量偏差为500 u；4) 运用Cytoscape软件使分析结果可视化。

2 结果与讨论

根据1.4.3节创建的分子网络，在GNPS中匹配10种化合物。结合质谱数据信息，提取已知化合物，匹配化合物的结构需通过标准品或文献报道进行验证，排除假阳性结果。再根据每个化合物簇中节点与节点之间的相关性，通过文献信息与质谱裂解规律，推测与已知化合物结构相似的类似物或其他未知物，与GNPS没有匹配到的化合物类型根据文献信息手动解析。

夏天无75%乙醇提取物的总离子流图示于图1，构建的分子网络图示于图2。基于分子网络中已匹配的化合物类型，初步判断4个已知化合物类型的粒子簇，再结合质谱信息，确定3个未知化合物类型的粒子簇，包括E簇、F簇和G簇。最终识别出52个生物碱，推断出31个生物碱结构，其特征性二级质谱数据列于表1。

图1 夏天无75%乙醇提取物的总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of 75% ethanol extract from the rhizomes of Corydalis decumbens

注：a.普罗托品类；b.原小檗碱类；c.四氢小檗碱类；d.苯酞异喹啉类；e.简单异喹啉类；f.阿朴啡类；g.苄基异喹啉类图2 分子网络可视化图谱Fig.2 Visualization map of molecular network

表1 夏天无生物碱二级质谱数据Table 1 MS/MS data of alkaloids in the rhizomes of Corydalis decumbens

续表1

2.1 已知化合物簇的鉴定

2.1.1普罗托品类生物碱 根据分子网络中已经匹配的化合物别隐品碱(化合物38)，初步判断A簇为普罗托品类生物碱。此类生物碱不存在大π共轭系统，易发生RDA裂解，当R1、R2位置分别具有2个甲氧基、亚甲二氧基、甲氧基和羟基时，其特征碎片分别为m/z222、206、208，裂解后的碎片会继续失去一些小分子片段；另一个裂解特征是母核容易失去1分子H2O形成闭合四元环[11]。提取A簇中每个化合物的二级质谱数据，比较保留时间、母离子质量和相关文献[11-13]，排除具有相似碎片的非生物碱及重复峰，共鉴定出18种化合物为普罗托品类生物碱。以化合物31、37、38、42为例，详细阐明此类生物碱的鉴定过程。

分子网络中，别隐品碱的准分子离子为m/z370.169 7，分子式为C21H23NO5，其高能通道质谱的碎片离子m/z336[M+H-H2O-CH4]+、m/z206[M+H-C10H12O2]+、m/z188[M+H-C10H12O2-H2O]+和m/z189[M+H-C10H12O2-H2O-OH]+等与文献[11]报道一致，推测化合物38为别隐品碱。化合物31、37、42的准分子离子为m/z354.146 4、386.194 3、384.143 7，它们的结构式没有与GNPS匹配。化合物31的二级质谱中，m/z206、149为发生RDA裂解的碎片，相对丰度最高的碎片m/z188、189是通过RDA裂解后进一步脱水和脱羟基产生的，碎片m/z336[M+H-H2O]+、m/z308[M+H-H2O-CO]+、m/z275[M+H-H2O-CO-CH7N]+、m/z247[M+H-H2O-CO-CH7N-CO]+与标准品的碎片信息相同，参考文献[12]，推测化合物31为原阿片碱。化合物52与31的分子式相同，具有部分相似的特征碎片，推断为原阿片碱的同分异构体。化合物37和42具有丰度较高的m/z222、206，推测在R1、R2位置分别具有2个甲氧基和亚甲二氧基，结合文献[13]，推测其分别为隐品巴马汀和紫堇维定。原阿片碱的质谱图和普罗托品类生物碱可能的裂解途径示于图3。

图3 原阿片碱质谱图(a)和普罗托品类生物碱可能的裂解途径(b)Fig.3 MS spectrum of protopine (a) and possible fragmentation pathways of protopine-type alkaloids (b)

2.1.2原小檗碱类生物碱 根据分子网络中已经匹配的化合物药根碱(化合物43)、小檗碱(化合物49)和巴马汀(化合物50)，初步判断B簇为原小檗碱类生物碱。此类生物碱的母核一般不会发生裂解，主要是小分子取代基的裂解与丢失，很少存在低于m/z200的产物离子。当取代基包含2个或多个甲氧基时，特征碎片离子为[M-CH4]+、[M-CH3]+和[M-2CH3]+；当取代基包含亚甲二氧基时，特征碎片离子为[M-CH2O]+；当取代基包含羟基时，易产生失去1分子水的碎片离子。提取B簇中每个化合物的二级质谱数据，比较保留时间、母离子质量和相关文献[11,14]，共鉴定出6种化合物，全部为原小檗碱类生物碱。以化合物43、49、51为例，详细阐明此类生物碱的鉴定过程。

分子网络中，小檗碱的分子离子为m/z336.122 4，分子式为C20H18NO4+，其碎片离子有m/z320[M-CH4]+和m/z292[M-CH4-CO]+，表明该化合物存在相邻的甲氧基；碎片离子m/z306[M-CH2O]+和m/z278[M-CH2O-CO]+，表明该化合物存在1个亚甲二氧基。结合标准品碎片信息，参考文献[14]，确定化合物49为小檗碱。药根碱的准分子离子为m/z338.137 7，特征碎片离子为m/z322[M-CH4]+、m/z294[M-CH4-CO]+和m/z320[M-H2O]+，表明该化合物含有邻甲氧基和羟基，参考文献[14]，确定化合物43为药根碱。化合物51的准分子离子为m/z366.169 9，没有在GNPS中匹配，碎片离子为m/z350[M-CH4]+、m/z351[M-CH3]+和m/z336[M-2CH3]+，推测该化合物存在2个邻甲氧基，结合母离子质量，说明C13位置含有1个甲基，故推测该化合物为二氢巴马汀。小檗碱的质谱图和原小檗碱类生物碱可能的裂解途径示于图4。

2.1.3四氢原小檗碱类生物碱 根据分子网络中已经匹配的化合物延胡索单酚碱(化合物27)、金黄紫堇碱(化合物20)、四氢巴马汀(化合物40)和氢化小檗碱(化合物44)，初步判断C簇为原小檗碱类生物碱。此类生物碱C环结构已饱和，在质谱中易发生RDA裂解并继续丢失一些取代基，或发生B环断裂，很少存在质荷比高于m/z200的产物离子。RDA裂解产生高丰度的含氮片段，作为四氢小檗碱型生物碱的特征片段，特征离子与R1和R2位置的取代基类型有关。当R1和R2位置分别具有2个甲氧基、亚甲二氧基、1个甲氧基和1个羟基时，特征离子分别为m/z192、176、178。提取C簇中每个化合物的二级质谱数据，推测出4个没有在GNPS中匹配的化合物结构。

C簇中，m/z357.193 0[M+H]+、m/z342.179 0[M+H]+、m/z342.168 6[M+H]+、m/z354.132 2[M+H]+、m/z340.154 7[M+H]+没有在GNPS中匹配，其中m/z357.193 0[M+H]+是有相似特征碎片的非生物碱。m/z342.179 0[M+H]+和m/z342.168 6[M+H]+的分子式为C20H23NO4。前者含有高丰度的含氮碎片m/z178，存在1个甲氧基和1个羟基，参考文献[15]，推测其为四氢非洲防己碱(化合物28)；后者含有高丰度的碎片m/z192，说明其存在邻甲氧基，参考文献[16]，推测其为紫堇达明碱(化合物24)。按照类似方法，推测m/z340.154 7[M+H]+为氢化小檗碱。m/z354.132 2[M+H]+比四氢小檗碱低2 u，产生高丰度的碎片离子m/z190[M+H-C10H12O2]+、m/z188[M+H-C10H14O2-CH3]+和m/z160[M+H-C10H10O2-CH3OH]+，所推测的化学结构在Scifinder、Chemspider数据库中没有显示，其为潜在的新化合物。四氢巴马汀的质谱图和四氢原小檗碱类生物碱可能的裂解途径示于图5。

图4 小檗碱质谱图(a)和原小檗碱类生物碱可能的裂解途径(b)Fig.4 MS spectrum of berberine (a) and possible fragmentation pathways of protoberberine-type alkaloids (b)

2.1.4苯酞异喹啉类生物碱 根据分子网络中已经匹配的化合物比枯枯灵(化合物22)，初步推断D簇为苯酞异喹啉类生物碱。此类生物碱很少报道，以比枯枯灵为对照品，其二级质谱的准分子离子峰为m/z368.118 7[M+H]+，产生m/z307[M+H-CH3NH2-CH2O]+碎片离子，接着失去1分子CH2O和CO，产生m/z277[M+H-CH3NH2-(CH2O)2]+和m/z249[M+H-CH3NH2-(CH2O)2-CO]+碎片离子。其中，m/z277、249的丰度较高，是该化合物的特征碎片离子，m/z190为母核裂解产生的碎片离子。化合物22的二级质谱碎片与对照品相似，参考文献[17]，确定其为比枯枯灵。

D簇中，其余3个化合物m/z368.112 7[M+H]+、m/z370.129 0[M+H]+、m/z384.143 1[M+H]+的结构没有在GNPS中匹配，由于都含有碎片m/z190，说明R1和R2位置均是亚甲二氧基，其中m/z368.112 7[M+H]+(化合物17)与比枯枯灵互为同分异构体，但它们产生的碎片略有不同，可能是因为2个氢原子的构象不同。由于CH3NH2、CH2O和H2分子的连续丢失以及键的裂解，化合物17产生m/z275[M+H-CH3NH2-2CH2O-H2]+碎片离子，接着失去1分子CO，产生m/z247[M+H-CH3NH2-2CH2O-H2-CO]+碎片离子，参考文献[18]，推测化合物17为夏无碱。

图5 四氢巴马汀质谱图(a)和四氢原小檗碱类生物碱可能的裂解途径(b)Fig.5 MS spectrum of tetrahydropalmatine (a) and possible fragmentation pathways of tetrahydroprotoberberine-type alkaloids (b)

m/z370.129[M+H]+和m/z384.143 1[M+H]+的质谱裂解信息与比枯枯灵相同，参考文献[19-20]，推测其分别为苏元胡碱甲和(-)-7′-O-甲基夏无碱。比枯枯灵的质谱图和苯酞异喹啉类生物碱可能的裂解途径示于图6。

2.2 未知化合物簇的鉴定

2.2.1阿朴啡类生物碱 阿朴啡类生物碱与其他生物碱在结构上存在较大的差异，如果结构中存在氮甲基，由于酰胺基中存在1个弱键，此类生物碱容易中性丢失(CH3)2NH或CH3NH2取代基，从而产生[M+H-45]+或[M+H-31]+特征片段。阿朴啡类生物碱只有侧链的断裂与重组，不会形成m/z较低、丰度较大的碎片离子[21]。通过与分子网络中未知粒子簇的比对，锁定F簇为此类生物碱，共鉴定出5个阿朴啡类生物碱。以化合物12和14为例，阐述此类生物碱的鉴定过程。化合物14的准分子离子峰为m/z326.138 4，m/z295[M+H-31]+为中性丢失CH3NH2，之后失去CH3OH形成m/z263碎片，说明其存在相邻的羟基和甲氧基，m/z235离子是m/z263丢失1个CO分子形成的，参考文献[22]，推测化合物14为球紫堇碱。化合物12的准分子离子为m/z342.169 5，二级质谱图中未发现中性丢失(CH3)2NH形成的m/z297[M+H-45]+碎片峰，m/z282、265、237离子可能是m/z297离子连续失去甲基、羟基自由基和1分子CO形成的，参考文献[21]，推测化合物12为木兰花碱，其可能的裂解途径示于图7。

2.2.2苄基异喹啉类生物碱 苄基异喹啉类生物碱与阿朴啡类生物碱的裂解途径相似，容易中性丢失CH3NH2取代基，然后连续丢失一些小分子或者发生α裂解。不同的是，苄基异喹啉类生物碱没有大π共轭系统，会发生母核骨架断裂，根据苄基所连接基团的不同，形成m/z107、137、151特征碎片，母核上的氮原子没有丢失，形成1个偶数的碎片峰[23]。据此推断G粒子簇为苄基异喹啉类生物碱，通过提取二级质谱数据，鉴定出8个化合物，其中有3个已知化合物，分别为化合物10、15和18。化合物10的准分子离子峰为m/z344.194 8，产生m/z151特征碎片，说明R1和R2为相邻的甲氧基；化合物15的准分子离子峰为m/z330.170 1，产生m/z137特征碎片，说明R1和R2为相邻的甲氧基和羟基；化合物18的准分子离子峰为m/z314.175 0，产生m/z107特征碎片，说明R1和R2为相邻的氢和羟基。这3个化合物均未观察到准分子离子丢失CH3NH2后形成的离子，但随后连续丢失一些小分子或者发生α裂解产生的碎片为取代基分配提供了支撑，参考文献[17-18,24]，推测化合物10，15和18分别为可旦民碱、网络番荔枝碱和亚美罂粟碱。苄基异喹啉类生物碱可能的裂解途径示于图8。

图6 比枯枯灵质谱图(a)和苯酞异喹啉类生物碱可能的裂解途径(b)Fig.6 MS spectrum of bicuculline (a) and possible fragmentation pathways of phthalide-type alkaloids (b)

图7 阿朴啡类生物碱可能的裂解途径Fig.7 Possible fragmentation pathways of aporphine alkaloids

图8 苄基异喹啉生物碱可能的裂解途径Fig.8 Possible fragmentation pathways of benzylisoquinoline alkaloids

2.2.3简单异喹啉类生物碱 分子网络中，粒子簇E中不存在高于m/z200的正离子，由此判断此粒子簇为简单异喹啉类生物碱，共鉴定出3个化合物。化合物1的准分子离子为m/z192.101 7，连续失去1分子CH4和2分子CO，形成m/z176、148、120碎片离子，参考文献[17]，推测该化合物为氢乙种北美黄连碱。化合物2和3的分子式为C11H11NO2，含有相同的碎片信息，保留时间差异大，互为位置异构体，均从母核上连续丢失-CH3、-CO和-OCH2，形成m/z175、147、117的碎片离子，参考文献[25]，推测化合物2和3分别为2,4-二甲氧基喹啉或6,7-二甲氧基喹啉。

HPLC-Q-TOF-MS/MS技术结合分子网络可以提高化合物筛查和鉴定的效率。目前GNPS数据库收录的天然产物大多数来自于微生物和海洋生物，为发现天然产物提供了很好的分析平台，但中药化学成分的收录相对较少，在一定程度上阻碍了分子网络技术在中药研究方面的应用。以苄基异喹啉类生物碱和阿朴啡类生物碱为例，在GNPS中没有匹配任何化合物，根据粒子簇中相关联节点的质谱信息，结合各类化合物的特征碎片及色谱保留行为，推断其可能的结构类型，再根据Scifinder、Chemspider等在线数据库中搜索的可能结构信息鉴定未知化合物。

3 结论

本实验建立了基于 HPLC-Q-TOF-MS/MS的分子网络方法快速分析夏天无中生物碱，结合对照品、化合物精确相对分子质量、特征离子、中性丢失和参考文献等，共鉴定了夏天无中52个异喹啉类生物碱成分，包括31个已知化合物结构和21个已知结构类型的未知物，并总结了夏天无中生物碱的裂解规律。该方法具有快速、准确、无需标准品等特点，可对多种类型化合物进行定性鉴别，为夏天无生物碱的进一步提取分离和药效物质基础研究提供了科学依据，为中药中天然产物的鉴定提供了方法参考。