秋水仙素处理对‘红阳’猕猴桃四倍体诱导的影响*

李良良，吴 迪，张怀山，王梦柳，李苇洁

（1贵州省山地资源研究所，贵阳550001）（2六盘水市农业科学研究院）

猕猴桃属猕猴桃科（Actinidiaceea）猕猴桃属（Actinidia）藤本植物，共有54个种，其中原产于中国的有52种[1]。‘红阳’是四川省选育的品种，属于中华猕猴桃系列，果实短圆柱形，单果重70～100 g，果皮绿色，密被腺点，鲜果横剖面沿果心有紫红色线条呈放射状分布，色彩鲜美，果肉细嫩，果味香甜，深受消费者喜爱[2]。猕猴桃属植物倍性复杂多样，目前已发现有二倍体到十二倍体植株的存在[3]。多倍体植株通常具有果实发育大、植株生长较为旺盛、产量较高、抗性较强等优点[4-7]。‘红阳’猕猴桃因倍性是二倍体，其抗病性、抗虫性、抗寒性不及生产上所用的六倍体美味猕猴桃，如何改良‘红阳’猕猴桃品种，提高其抗性成为我国猕猴桃产业发展急需解决的问题之一。

目前植物多倍体多采用化学方法中的秋水仙素处理[8]。秋水仙素能破坏纺锤体的形成，导致染色体的加倍[9]。韩礼星等[10]采用200 mg/L秋水仙素、300 mg/L 8-OH喹啉、500 mg/L对二氯苯处理猕猴桃1周左右成功得到多株嵌合体，但未见纯合多倍体。蒋洪恩等[11]采用秋水仙素处理成功得到枣的四倍体植株。诱变育种能有效克服远缘杂交不亲和，有效缩短育种年限，创造新的种质资源[12]。多倍体育种能提高猕猴桃果实单果重、避免膨大剂的使用，而国内外对倍性育种的研究还相对较少。刘丽等[13]用秋水仙素对‘琼露’猕猴桃进行处理，成功得到四倍体植株，并发现四倍体植株叶片变大，叶面变厚；张弛[14]以‘红阳’猕猴桃离体组培苗为试验材料，用0.2%秋水仙素浸泡48 h诱导率为20%。本研究在前人研究的基础上，采用秋水仙素浸泡‘红阳’猕猴桃新萌发愈伤组织的方法进行多倍体的诱导，以期能提高多倍体诱导率，获得单果重大、抗性强、适应性好的新种质。

1 材料与方法

1.1 试验材料

前期工作已经成功建立‘红阳’猕猴桃快繁体系[15]，选取刚刚萌发的‘红阳’猕猴桃愈伤组织作为试验材料。

1.2 多倍体的诱导和不定芽的再生

在超净工作台上取‘红阳’猕猴桃新萌发的幼嫩愈伤组织，分别浸泡在经过抽滤灭菌的50、100、150 mg/L的秋水仙素溶液中3、4、5、6 h[13]，以浸泡在无菌水中处理5 h作为对照。吸水纸吸干后，接种在MS+2 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂的再生培养基上，光照度2 500 lx、时间16 h/d、25 ℃的条件下进行培养，每个处理接种50个愈伤组织，30 d后观察愈伤组织的成活情况。分离愈伤组织长出的不定芽，转接到MS+1 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂的增殖培养基上进行培养，进行多倍体的鉴定。

1.3 多倍体鉴定

取0.5 cm2的再生新梢叶片放在洁净的培养皿中，加入400 mL细胞裂解液（Partec HR-A），用锋利的刀片快速剁碎，裂解2 min，将样品通过30 μmol Partec Celltrics TM微孔膜过滤到上样管中，加入DAPI染色液1 600 mL（Partec HR-B）染色1 min。采用德国Partec公司生产的流式细胞仪进行分析。

1.4 验证试验

在前期试验的基础上，用已经得到的最佳诱导‘红阳’猕猴桃四倍体植株的秋水仙素浓度和处理时间对‘红阳’猕猴桃健康的愈伤组织100个进行诱导，再将不定芽分成单株，转接到MS+1 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂的增殖培养基上进行培养，进行多倍体的鉴定。进一步验证此配方对‘红阳’猕猴桃愈伤组织的成活率和诱导率的影响，以得到更多的‘红阳’猕猴桃四倍体和嵌合体。

2 结果与分析

2.1 秋水仙素对‘红阳’猕猴桃愈伤组织存活率的影响

从表1可以看出，愈伤组织的存活率随着秋水仙素浓度和处理时间的增加而逐渐降低。对照处理5 h后，愈伤组织存活率为96%；秋水仙素浓度为50 mg/L时，愈伤组织存活率由82%下降到60%；秋水仙素浓度为100 mg/L时，愈伤组织存活率由78%下降到58%；秋水仙素浓度为150 mg/L时，愈伤组织存活率由66%下降到18%。可见，秋水仙素处理后愈伤组织存活率均低于对照。在处理时间为3 h的条件下，秋水仙素浓度为50、100、150 mg/L时，愈伤组织存活率分别为82%、78%、66%。

表1 秋水仙素处理对愈伤组织存活率的影响

2.2 秋水仙素对‘红阳’猕猴桃倍性及变异率的影响

采用流式细胞仪分析细胞核的相对含量，结果表明：1株为四倍体植株（图1-A），有1个峰值，其细胞核相对含量为200；14株为嵌合体（图1-B），有2个峰值，其细胞核相对含量分别为100、200；对照为二倍体植株（图1-C），有1个峰值，其细胞核相对含量为100。

图1 不同倍性细胞核DNA的相对含量

从表2可以看出，用100 mg/L的秋水仙素浸泡‘红阳’猕猴桃愈伤组织5 h变异率达到23.68%，其中四倍体植株1株，嵌合体8株，其余浓度秋水仙素处理均未能得到四倍体植株。通过进一步的观察发现，经过秋水仙素处理得到的四倍体植株与对照二倍体植株有明显的差异，与对照相比，叶片加厚、加大，叶面变得粗糙，但出现明显的畸形（图版2），生长明显变得缓慢。

表2 秋水仙素处理对植株变异率的影响

2.3 验证试验结果

前期试验结果显示，用100 mg/L秋水仙素处理‘红阳’猕猴桃愈伤组织5 h，变异率为23.68%，得到1株四倍体和8株嵌合体，变异率最高，效果最好。

在前期工作的基础上，进一步验证试验结果显示：用100 mg/L秋水仙素浸泡愈伤组织5 h，100个愈伤组织成活69株，其余均变黑褐化死亡，其愈伤组织成活率达到69%；对成活的69株进行不定芽的诱导，待不定芽长至2～3片幼嫩的叶片，开始分离不定芽，得到成活的不定芽共196株；采用流失细胞仪对得到的196株不定芽检测发现，变异植株47株，其中有6株四倍体，其余均为嵌合体，变异率达到23.97%。6株‘红阳’猕猴桃四倍体植株均表现出长势较弱、叶片有明显畸形，与前期诱导试验结果一致。

3 讨论与结论

猕猴桃作为多年生藤本经济作物，育种周期较长而导致育种速度缓慢，目前常用的育种手段为杂交，但其随机性比较强，而倍性育种目的较为明确，可较快地创新种质资源，有效丰富育种材料。目前，多倍体的诱导多采用秋水仙素处理发芽的种子以及幼嫩的叶片等，以进一步得到倍性变化的植株[16]。本研究对‘红阳’猕猴桃愈伤组织进行秋水仙素处理以诱导四倍体，因愈伤组织细胞分裂快、结构更加疏松，秋水仙素能更好地和细胞进行接触，对细胞产生更好的诱导效果。秋水仙素诱导只有在合适的浓度和时间范围内才能成功。但秋水仙素是一种有毒制剂，周慧文等研究表明，长时间的浸泡能导致植株的大概率死亡[17]，与本研究的结果一致。

前人多采用染色体计数法和去壁低渗火焰干燥法统计植物的倍性[6]，此种方法较为繁琐，材料浪费现象比较严重，流式细胞仪作为一种新兴的鉴定方法[18]，已经在多种果树上得到了验证和应用，但是价格相对较为昂贵[19]。本研究以100 mg/L秋水仙素浸泡‘红阳’猕猴桃愈伤组织5 h，得到四倍体植株只有1株，嵌合体有8株。通过验证试验进一步表明，100 mg/L秋水仙素浸泡‘红阳’猕猴桃愈伤组织5 h变异率达到23.97%，并得到47株变异植株，其中6株为四倍体植株，比秋水仙素直接处理组培苗茎尖的诱导率为20%[14]要高，这可能跟愈伤组织细胞松散与秋水仙素接触面积更大，进而提高了诱导率有关。四倍体植株与二倍体植株相比，叶片变大，叶面变厚，但是畸形较为严重，后续能否长出完整的植株，还需要进一步观察。本试验得到多株嵌合体，能否从嵌合体中通过叶片离体再生技术分离出同质突变体[20]还需要进一步研究。