大竹蛏Solen grandis 耗氧率及排氨率响应面法分析

张雨，陈爱华，吴杨平，曹奕，陈素华，张志东,2，田镇,2，李秋洁,2

（1.江苏省海洋水产研究所，江苏 南通 226007；2.上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心，上海 201306）

大竹蛏Solen grandis 俗称蛏子王，是广泛分布我国沿海的经济贝类之一，在江苏吕四渔场内如东、启东一线历来具有相当的资源量。但近年来围填海和港口建设等因素不同程度影响了海洋生境，大竹蛏呼吸代谢状态受到严重挑战。本课题组尝试进行大竹蛏池塘养殖。转向池塘养殖的大竹蛏因养殖地点的不同，海水盐度、温度及pH 等也存在显著差异。研究表明，盐度影响水生动物鳃纤毛运动和心脏的跳动[1,2]；温度和pH 变化改变了生物体内各种酶的活力，影响水生动物的呼吸代谢[3,4]。耗氧率和排氨率是反映水生动物呼吸代谢的重要指标，估算贝类养殖容量的重要参数[5]。目前有关鱼类[6-8]、甲壳类[9,10]及贝类[11-14]耗氧率和排氨率的研究均有报道。然而目前仅限于单一环境因素的研究，较少考虑环境因素的联合作用。而研究多种环境联合条件下大竹蛏的呼吸代谢状况，对大竹蛏池塘健康养殖具有积极意义。

响应面法是一种解决多变量问题的数学统计分析方法，主要通过提供合理的试验设计和数据统计分析、评价多种变量之间的交互作用而建立数学模型和三维立体响应曲面图形，最终得出最优参数组合的多元回归方程[15-17]。目前响应面法已较多地运用在工艺优化和药物研发等领域[18]，而在水产动物中的运用研究较少。本研究利用响应面法研究盐度、温度和pH 三因素及其联合效应对大竹蛏耗氧率及排氨率的影响，利用多元回归方程模拟出大竹蛏耗氧率及排氨率最高时的养殖条件，以期为大竹蛏养殖条件优化、人工苗种繁育和增殖放流提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

实验用大竹蛏平均体质量（5.42±0.23）g，取自江苏省海洋水产研究所文蛤良种场，选取规格相似，健康无损的个体在聚乙烯水槽中暂养7 d，投喂105ind·mL-1的球等鞭金藻Isochrysis galbana，每日换水一次，实验开始前停喂1 d。

1.2 单因素实验

1.2.1 盐度对大竹蛏耗氧率及排氨率的影响

参照朱晓闻[4]等试验方法，实验在聚乙烯桶中的恒温密闭呼吸瓶中进行，每个桶中放3 个大竹蛏，温度为26℃，pH 为7.82。用沙滤海水、海水晶和淡水将盐度调节为22、25、28、31 和34，设3 个重复。实验在白天进行，持续2 h，分别用溶氧仪和氨氮测定仪测定初始和结束时呼吸瓶中海水的溶解氧和氨氮浓度。实验结束时在精确度0.0001 g 的电子天平上精确称量大竹蛏总重。

1.2.2 温度对大竹蛏耗氧率及排氨率的影响

设5 个温度梯度：20℃、23℃、26℃、29℃和32℃，每个温度设3 个重复，室温为26℃，采用冰块或加热板调节温度，实验盐度为28，pH 为7.82。实验装置及方法同1.2.1。

1.2.3 pH 对大竹蛏耗氧率及排氨率的影响

设5 个pH 梯度：7、7.5、8、8.5 和9，每个pH 设3 个重复，室温为26℃，通过添加NaOH 或HCl 调节至相应pH。实验盐度为28，温度为26℃。实验装置及方法同1.2.1。

1.3 多因素实验

在单因素实验的基础上，以大竹蛏耗氧率和排氨率为指标，运用Box-Behnken 模型，选择三因素三水平的中心组合方案，以盐度、温度和pH 为主要考察因素，进行响应面实验，实验因素水平编码见表1，实验装置及方法同1.2.1。

表1 因素水平表Tab.1 The design table of factors and levels

1.4 耗氧率及排氨率的测定

分别用YSI 溶氧仪和次溴酸钠氧化法测定初始和结束时呼吸瓶中海水的溶解氧和氨氮含量。耗氧率OC 及排氨率AE 的计算公式如下：

式中：OC 为单位大竹蛏体质量的耗氧率（mg·g-1·h-1），DO0和DOt分别为实验开始和结束时水中的溶解氧量（mg·L-1），AE 为单位体质量的排氨率（μg·g-1·h-1），N0和Nt分别为实验开始和结束时水中NH4+-N 含量（mg·L-1），V 为呼吸瓶体积（L），W 为大竹蛏总重（g），t 为实验时间（h）。

1.5 数据统计

实验结果均以平均值±标准差（Mean±SD）表示。单因素实验数据用Excel2016 进行整理，用SPSS19.0 进行单因素方差（One-Way ANOVA）分析，最后用Origin8.0 作图。多因素实验根据Design-expert 8.0 软件中BBD 模型设计，用该软件进行二元二次多项式回归分析和方差分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 盐度对大竹蛏耗氧率及排氨率的影响

由图1 可知，盐度显著影响大竹蛏耗氧率与排氨率（P＜0.05），盐度22～28 时，大竹蛏耗氧率及排氨率均呈上升趋势，在盐度为28 时均达到最大值，OC=（0.48±0.10）mg·g-1·h-1，AE=（38.32±5.21）μg·g-1·h-1；盐度超过28 时，耗氧率及排氨率均呈下降趋势。单因素方差分析表明，盐度28 时，显著高于在盐度22 与34 时的耗氧率（P＜0.05），与盐度25和31 时的耗氧率差异不显著（P＞0.05）；排氨率在盐度28 时，显著高于其他盐度组（P＜0.05）。

图1 不同盐度对大竹蛏耗氧率及排氨率的影响Fig.1 Effects of different salinities on oxygen consumption rate and ammonia excretion rate of razor clam Solen grandis

2.1.2 温度对大竹蛏耗氧率及排氨率的影响

不同温度下，大竹蛏耗氧率及排氨率如图2 所示：在20～26℃时，大竹蛏耗氧率及排氨率均随温度的升高而增加；在26℃时，大竹蛏耗氧率及排氨率达峰值，OC=（0.49±0.07）mg·g-1·h-1，AE=（39.13±3.23）μg·g-1·h-1；超过26℃后，大竹蛏耗氧率及排氨率呈下降趋势。单因素方差分析表明，26℃时显著高于20℃、29℃及32℃的耗氧率（P＜0.05），与23℃时的耗氧率差异不显著（P＞0.05）；温度26℃时，排氨率显著高于其他温度组（P＜0.05）。

图2 不同温度对大竹蛏耗氧率及排氨率的影响Fig.2 Effects of different temperature on oxygen consumption rate and ammonia excretion rate of razor clam Solen grandis

2.1.3 pH 对大竹蛏耗氧率及排氨率的影响

由图3 可知：pH 为7.0～8.0 时，大竹蛏耗氧率及排氨率均pH 的升高而升高；在pH 为8.0 时，大竹蛏耗氧率及排氨率均达到峰值，OC=（0.49±0.04）mg·g-1·h-1，AE=（36.25±6.23）μg·g-1·h-1；超过8.0后，大竹蛏的耗氧率及排氨率下降。单因素方差分析表明，pH 为8 时，大竹蛏的耗氧率及排氨率显著高于pH 为8.5 和9 时（P＜0.05），与pH7 和7.5 时的耗氧率差异不显著（P＞0.05）；pH 为8 时，显著高于在pH 为7、7.5 及9 时的排氨率（P＜0.05），与pH8.5时的排氨率差异不显著（P＞0.05）。

图3 不同pH 对大竹蛏耗氧率及排氨率的影响Fig.3 Effects of different pH values on oxygen consumption rate and ammonia excretion rate of razor clam Solen grandis

2.2 多因素实验响应面法分析

按照BBD 设计了17 组多因素实验，通过RSM建立回归模型，并对回归方程进行方差分析及显著性检验。结果显示，大竹蛏耗氧率及排氨率回归模型的F 值分别为149.49 和465.47，P-value 均小于0.0001，表明BBD 优化法可靠，变量对响应值的影响极为显著，模型具有统计学意义。其次，两个模型的拟合系数（R2）分别为0.9948 和0.9983，说明模型预测值与实测值拟合度高。校正决定系数（Adj R2）分别为0.9882 和0.9962，均可解释数据变异性的85%以上。精密度（Adeq Precisior）均大于25%，回归模型可准确用于结果分析。由表3 可知，温度一次效应对大竹蛏耗氧率的影响不显著（P＞0.05）；盐度和pH 一次效应对大竹蛏耗氧率的影响显著（P＜0.05）；盐度、温度及pH 交互效应对大竹蛏耗氧率影响不显著（P＞0.05），盐度、温度及pH 二次效应对大竹蛏耗氧率的影响显著（P＜0.05）。因此需要剔除交互作用项，然后对模型重新进行回归。根据方差分析结果得出大竹蛏耗氧率OC 与盐度（A）、温度（B）及pH（C）的二次多项回归方程。大竹蛏预测值OC 对编码值自变量A、B 和C 的二次多项回归方程为：OC=0.48-8.75×10-3A-5×10-3B-0.011C-0.088A2-0.1B2-0.098C2；大竹蛏预测值OC 对实际值自变量A、B 和C 的二次多项回归方程为：OC=-39.51+0.56A+0.56B+6.27C-9.72×10-3A2-0.01B2-0.39C2。

由表4 可知，盐度及pH 一次效应对大竹蛏排氨率的影响显著（P＜0.05），温度对大竹蛏排氨率的影响不显著（P＞0.05）；温度与盐度、盐度与pH 交互效应大竹蛏排氨率影响不显著（P＞0.05），温度与pH交互效应对大竹蛏排氨率影响显著（P＞0.05）；盐度、温度及pH 二次效应对大竹蛏排氨率影响显著（P＜0.05）。根据方差分析结果得出大竹蛏排氨率AE与盐度（A）、温度（B）及pH（C）的二次多项回归方程大竹蛏预测值AE 对编码值自变量A、B和C 的二次多项回归方程。

表2 实验设计与结果Tab.2 Box-Behnken design with the observed responses

表4 大竹蛏排氨率回归模型方差分析Tab.4 ANOVA for the regression model of ammonia excretion rate (AE) in razor clam Solen grandis

大竹蛏预测值AE 对编码值自变量A、B 和C的二次多项回归方程为：AE=38.85+1.37A-0.30B+2.91C+0.085AB+0.19AC-0.87BC-6.75A2-7.89B2-11.54C2。

大竹蛏预测值AE 对实际值自变量A、B 和C 的二次多项回归方程为：AE=-4238.24+41.23A+49.83B+755.92C+9.44×10-3AB+0.13AC-0.58BC-0.75A2-0.88B2-46.16C2。

根据所建立的上述数学模型，得出大竹蛏耗氧率及排氨率的最佳条件为：盐度28.04，温度25.93℃，pH8.02，此条件下大竹蛏的耗氧率及排氨率分别为0.48 mg·g-1·h-1和38.97 μg·g-1·h-1。

3 讨论

盐度对贝类呼吸和代谢有重要影响。一般认为，盐度的改变不仅影响贝类的摄食能力，还影响鳃纤毛运动和心脏的跳动。盐度过高或过低时，贝类会关闭进出水管，紧闭双壳，形成组织和外部条件的隔离，呼吸和排泄减慢[1,2]。本研究结果显示：盐度的一次效应对大竹蛏耗氧率及排氨率影响显著（P＜0.05）。在盐度22～31 范围内，大竹蛏耗氧率及排氨率呈先增大后减小的变化规律，盐度28 时，耗氧率与排氨率最大。这与九孔鲍Haliotis diversicolor supertexta[19]、毛蚶Scapharca subcrenata[20]、褐菖鲉Sebastisucus marmoratus[21]及黄斑篮子鱼Siganus oramin[22]等耗氧率及排氨率随盐度变化规律一致。

温度的变化会引起生物体内各种酶活力的变化，影响生物的新陈代谢[3]。本实验结果表明，温度20～32℃时，大竹蛏耗氧率及排氨率呈先增大后减小的变化规律，26℃时，大竹蛏耗氧率及排氨率最大。这与褶纹冠蚌Cristaria plicata、背角无齿蚌Anodonta woodiana、河蚬Corbicula fluminea、铜锈环棱螺Bellamya aeruginosa 等[23]耗氧率及排氨率变化规律相同。水体pH 不仅影响水产动物新陈代谢，还会影响贝类血液的pH 和贝壳的分泌与形成[4]。本试验结果表明，pH 的一次效应和二次效应对大竹蛏耗氧率和排氨率的影响极显著（P＜0.01）。在pH 7.0～9.0 范围内，大竹蛏耗氧率及排氨率呈先增大后减小的变化规律，pH 为8 时，大竹蛏耗氧率与排氨率达到最大。这与缢蛏Sinonovacula constricta[5]、鲻Mugil cephalus[24]及 尖 紫 蛤Soletellina acuta[25]耗 氧率和排氨率变化规律相似。其原因可能是pH 过高或者过低均会损坏贝类鳃纤毛的组织细胞，抑制鳃纤毛的活力，不同程度影响贝类的呼吸与排泄[26]。具体分子机制还需进一步研究。

对贝类耗氧率及排氨率的研究较少考察环境因素的联合作用及曲面效应。本试验分析了盐度、温度和pH 的交互作用对大竹蛏耗氧率及排氨率的影响，构建的Box-Behnken 模型拟合度很高，说明该模型能很好地解释大竹蛏耗氧率及排氨率随环境因素的变化。研究大竹蛏呼吸代谢的最佳条件时，还应进一步考虑放养密度和规格、底质条件、溶氧水平等交互作用对耗氧率及排氨率的影响。利用Design-expert 8.0 统计软件分析了影响大竹蛏耗氧率及排氨率的3 个因素及其交互作用，得出大竹蛏的最佳呼吸代谢条件为：盐度28.04，温度25.93℃，pH8.02，此条件下大竹蛏的耗氧率及排氨率分别为0.48 mg·g-1·h-1和38.97 μg·g-1·h-1。在此环境条件下大竹蛏代谢旺盛，而温度、盐度和pH 的联合效应对于大竹蛏生长和生理的影响还需进一步探讨。