一个鳃-耳-肾综合征家系EYA1基因新致病性变异△

王贺贺 孙敬武 万光伦，2 陈浩，2 李万举，2 赵婉，2 潘春晨，2

鳃-耳-肾综合征(branchio-oto-renal，BOR)是一种罕见的常染色体显性遗传疾病，发病率约为1/40 000，占重度听力损失儿童的2%[1]。BOR综合征外显率高，主要的临床症状是听力损失，鳃瘘和耳前瘘管、外耳、耳道和中耳或内耳的畸形以及从发育不全到双侧的肾异常。最常见的表现是听力损失，可以是传导性、感音性或混合性[2]。患者通常表现为鳃、耳和肾的异常结合，临床表型多样，诊断非常困难[3]。

随着分子生物学的快速发展，多种基因检测工具相继出现，BOR综合征的致病基因相继被发现，目前已明确的BOR综合征致病基因有EYA1(8q13.3)、SIX1(14q23.1)和SIX5(19q13.32)[4]。在受影响的人群中，约40%是由EYA1基因突变引起的，因此常将EYA1基因检测作为BOR基因筛查的第一步。目前认为由于EYA1蛋白与SIX1蛋白相互作用形成保守的转录辅激活复合物，其作用是胎儿的鳃弓、听觉系统和肾脏发育所必需的，所以EYA1基因突变会导致胎儿上述系统的异常发育，从而导致BOR综合征的发生[5,6]。

本研究通过对一个BOR综合征家系进行Sanger法测序和蛋白功能预测软件进行遗传学分析，首次检测出中国人群中EYA1基因c.889C>T(p.R297X)位点的致病性突变，报告如下。

1 资料与方法

1.1临床资料 家系资料调查由安徽医科大学附属省立医院耳鼻咽喉头颈外科家系采集小组完成，本研究中先证者(III-3)为男性,2岁7个月，因颈部瘘管和耳前瘘管至我院耳鼻咽喉头颈外科就诊，家系成员包括三代9名成员(图1)。本次调查研究获得医院伦理委员会认可，所有研究对象均签署了知情同意书，未成年人由监护人签署知情同意书。

1.2病史采集和全身体格检查 对先证者及家族成员进行完整病史(出生史、耳聋病史、家族史、外伤史、耳毒性药物应用史等)采集和系统的全身体格检查。

1.3听力学检测及其他检查 对II代及III代所有家系成员进行常规纯音测听及声导抗检测，耳聋患者进行听性脑干反应(ABR)、耳声发射以及40 Hz听觉相关电位检测。根据WHO(1997)的听力损失标准评估听力损失程度：轻度听力损失(26～40 dB HL)、中度听力损失(41～60 dB HL)、重度听力损失(61～80 dB HL)及极重度听力损失(>80 dB HL)。家系中患病个体做了其他相关检查，包括血液学检查、中耳乳突CT、心脏彩超、肾脏B超、碘油造影等。

1.4遗传性耳聋基因芯片筛查 对II代及III代家系成员采集其外周血(EDTA采血管抽取外周静脉血3～8 ml)，用于基因组DNA提取与保存。运用遗传性聋基因芯片对先证者、III-1及III-2进行常见的遗传性耳聋基因GJB2(135 del G、176 del 16、299 del AT、235 del C)、GJB3(538 c>T)、SLC26A4(2168A>G、IVS7-2A>G)及mtDNA12S rRNA基因(1494C>T、1555C>T)的共9个位点检测。

1.5Sanger基因测序及变异致病性分析 经过DNA提取及质检，基因组文库构建，目标区域捕获测序及生物信息分析后得到候选变异位点，利用PCR和Sanger测序验证经分析筛选后得到的候选变异位点。EYA1基因扩增的引物如下：正向：5＇GCATCTGATACCTTAACCACTGC3＇；反向：5＇AACCTGTTGCCTCTCACCTTC3＇。使用贝克曼自动化工作站预设程序配置PCR扩增反应体系，并按如下步骤运行程序：96 ℃ 1 min30 s；96 ℃ 15 s，50 ℃ 6 s，60 ℃3 min30 s，28个循环；4 ℃ Holds。PCR产物使用3130XL测序仪进行毛细管电泳测序并在ABI 3130 Genetic Analyzer(Applied Biosystems)上进行分析，再在家系成员中进行共分离验证。采用Human Splicing Finder预测剪接软件对异常基因突变进行功能验证，利用美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)指南对基因变异进行致病性分析。PCR扩增产物纯化与测序工作由北京迈基诺检验所完成。

2 结果

2.1家系表型及听力检查结果 该家系共3代9人，4人发病，表现为常染色体显性遗传，均为语前聋，出生时即伴不同程度的听力损失，呈渐进性加重。先证者及家系中其他患病个体均表现为听力损失、颈前瘘管、外耳异常、肾异常及泪道溢液中的两种及以上的混合症状，症状轻重不等(表1)；先证者为III-3，男，2岁7个月，声导抗检查鼓室导抗图为双侧B型，III-2为右侧A型，左侧B型，其余家系成员鼓室导抗图均为双侧A型。

2.2影像学检查及血液学检测 4例患者中耳乳突CT及心脏彩超均未发现明显异常。先证者(III-3)肾脏B超提示左肾发育良好，右肾发育不全伴旋转不良；患者III-2肾脏B超提示双肾发育良好；患者III-1肾脏B超和腹部CT提示左肾发育良好，右肾异位发育不全伴旋转不良；患者II-2肾脏B超提示左肾发育良好，盆腔部位见大小约83 mm×46 mm的右侧异位肾(图2)；患者III-1及III-3的尿液检测结果正常，血液学检查结果见表2。

图2 该家系4例患者的肾脏影像学检查图像

表2 患者III-1及III-3的血液学检查结果

2.3遗传性耳聋基因芯片检测结果 患者III-1、III-2及先证者(III-3)的遗传性耳聋基因芯片检测结果均为野生型，未发现携带中国人最常见的4个耳聋基因突变。

2.4Sanger基因测序及变异致病性分析结果 Sanger基因测序峰图结果提示，先证者、患者II-2、III-1及III-2的EYA1基因c.889C>T(p.R297X)为突变型，且为无义突变，均为杂合变异，变异来源于II-2，II-1未发现该位点的变异，为野生型(图3)。利用蛋白功能预测软件SIFT、PolyPhen_2和REVEL进行EYA1基因变异致病性的分析，结果分别为未知、未知、未知(表3)，根据ACMG指南，该变异初步判定为致病性变异。

表3 该家系EYA1基因的致病性变异特点

图3 该家系4例患者EYA1基因突变的测序峰图

2.5先证者及患者III-1颈部瘘管及耳前瘘管的外科治疗 利用术前瘘管碘油造影和术中从颈部瘘管插入金属导丝的方法将瘘管完整切除；利用显微外科手术切除耳前瘘管，术后瘘管病理均提示符合鳃裂瘘管改变。

3 讨论

BOR综合征的患者通常表现为传导性、感音神经性或混合性听力损失，也可能有外耳、中耳或内耳畸形；其他症状包括鳃裂囊肿和颈部瘘管，以及肾脏结构和功能异常[7]。由于广泛的表型和家系之间以及家系内部的表型变异，Chang等[8]提出了BOR综合征临床诊断的表型标准。BOR综合征的诊断标准分为主要标准和次要标准，主要标准包括第二鳃弓异常、听力损失、耳前凹、耳廓畸形和肾异常；次要标准包括外耳道异常、中耳异常、内耳异常、耳前标记物、面部不对称和腭部异常。BOR综合征的诊断：有三个主要标准或两个主要标准加上两个次要标准或一个主要标准和家族史。本研究先证者及家系中其他患者均表现为听力损失、颈前瘘管、外耳异常、肾异常及泪道溢液中的两种及以上的混合症状，症状轻重不等，符合上述诊断标准，与已知BOR综合征的临床表型相符，未发现新的临床表型。

先证者及患者III-1的血液学检查结果除血糖略低外，余基本正常，可能一侧肾脏发育不良在BOR患者中早期表现并不明显，建议每半年或一年复查一次肾功能和肾脏B超，因为肾脏疾病是影响患者生活质量的最重要的预后因素[9]。患者II-2右侧肾异位，III-1右肾异位发育不全伴旋转不良，先证者右肾发育不全伴旋转不良，异常肾均在右侧，而不是左侧或者双侧。目前关于BOR综合征肾异常的报道中，肾异常的侧别未被具体分析,本研究考虑在BOR综合征家系中，如果两个及以上的变异个体存在肾脏异常，那么极大概率是在同侧，即肾异常的侧别在BOR综合征的遗传中保持着稳定性，当然这需要更多的BOR综合征家系来验证。

BOR综合征即使在同一家族，不同患病个体之间的临床表型变异较大，如本研究中各患病个体临床表型不尽相同，这也给BOR综合征的诊断带来了困难[10]。如本研究中先证者，首先考虑了遗传性耳聋，所以利用遗传性耳聋基因芯片检测，但结果均为野生型，待其余各项检查结果出来后，才考虑BOR综合征，利用Sanger法进行基因测序，最终发现EYA1基因c.889C> T(p.R297X)突变，确诊为BOR综合征。Orten等[11]在散发的家族中首次报道了该位点的突变，但是并未对该位点的致病性进行预测，他们从表型与基因突变类型的方面分析认为表型的严重程度与突变类型无关，即使在家系内部亦不稳定，并认为该位点可能为BOR综合征的突变热点。

尽管基因检测技术发展很快，但并不是所有的BOR综合征患者都能检测到基因突变，据报道，通过传统的基因检测，仍有约50%的BOR综合征患者未发现EYA1、SIX1和SIX5的致病性变异，可能是因为这些患者存在位于这些基因的未发现区域或新基因中的变异[12]。自Abdelhak等[13]发现EYA1基因突变可导致BOR综合征以来，目前已经发现200多个不同的EYA1突变可以导致BOR综合征；在导致BOR综合征的已知突变中，在中国人群中目前仅发现c.466C>T、c.1735delG、c.1381delA、c.967A>T和c.1493insat等少数的几种突变[14～18]，本研究首次在中国人群中发现EYA1基因 c.889C> T(p.R297X)突变，扩展了中国BOR综合征人群的疾病基因谱。

综上所述，本研究首次在中国BOR综合征人群中检测到EYA1基因 c.889C> T(p.R297X)突变，且在该BOR综合征家系中，肾异常的遗传似乎保持着稳定性。建议在条件允许的情况下运用临床表型诊断标准与基因诊断相结合的方法对BOR综合征进行诊断，以降低BOR的漏诊率。