成都市54025例早产儿葡萄糖‐6‐磷酸脱氢酶缺乏症筛查结果及分子遗传学特征分析

姜舟 王梅 唐立 李晓丽 李春荣 程昕然

（电子科技大学医学院附属妇女儿童医院/成都市妇女儿童中心医院1.新生儿疾病筛查科；2.保健部；3.内分泌遗传代谢科，四川成都 611731）

葡萄糖 ‐6‐磷酸脱氢酶（glucose‐6‐phosphate dehydrogenase, G6PD）缺乏症，是X染色体连锁不完全显性遗传病。G6PD缺乏症是新生儿高胆红素血症常见和重要的危险因素，也是G6PD缺乏症高发区新生儿胆红素脑病的主要病因，且早产儿表现重于足月儿[1]。通过新生儿疾病筛查检测 G6PD 活性可早期发现、诊断和防治G6PD缺乏症。目前成都地区G6PD筛查的流程对早产儿与足月儿完全相同，是否需要根据早产儿自身特点对现有的筛查流程进行调整是下一步工作需要考虑的问题。本文拟通过回顾性研究成都市2015年1月1日至2019年12月31日进行筛查的54 025例早产儿G6PD缺乏症筛查情况，为成都市早产儿筛查工作改进提供建议。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2015年1月1日至2019年12月31日成都市早产儿G6PD筛查结果。研究对象为在此期间成都市新生儿疾病筛查中心管辖范围内23个区市县出生的所有活产早产儿，并进行了新生儿疾病筛查者，共计54 025例。主要分析上述早产儿的G6PD筛查数据及可疑阳性者的G6PD基因检测结果。本研究征得新生儿监护人的知情同意，均签署新生儿疾病筛查知情同意书及基因检测同意书。

1.2 标本采集

按照2009年国家卫生部颁布的《新生儿疾病筛查管理办法》[2]，新生儿出生72 h后，在其足跟外侧采血，滴于专用采血滤纸片（Whatman903TM，FH‐A‐01型，广州丰华生物工程有限公司），正面渗透至背面，共采集4个血斑。将血片置于室内水平位置自然通风，避光、避免紫外线及臭氧影响，晾干后装入塑料袋内封口，置于2~8℃ 冰箱保存，每周 1次快递到成都市新生儿疾病筛查中心行实验室检测。

1.3 筛查及确诊

1.3.1 筛查方法筛查试剂和仪器使用广州丰华公司提供的G6PD 测定试剂盒（荧光分析法）及Auto TRFIA‐4，检测G6PD酶活性。筛查切值男性：2.8 U/g Hb，女性：3.3 U/g Hb。初筛值低于以上水平即为初筛阳性患儿，需通知患儿回筛查中心进行确诊。

1.3.2 确诊方法以下任意1种方式均可确诊：（1）G6PD酶活性测定法：试剂使用北京利德曼生化公司提供的酶法试剂盒，仪器为日立008AS全自动生化分析仪。患儿静脉血G6PD酶活性值＜1 300 U/L即可确诊G6PD缺乏症。（2）基因诊断法确诊：使用宏石SLAN‐96S全自动医用PCR分析系统，厦门至善生物科技有限公司的G6PD基因突变检测试剂盒（荧光PCR溶解曲线法）进行检测。该试剂盒包含9种我国最常见的致病性变异[1]。检测到G6PD基因突变即可确诊G6PD缺乏症。对酶活性检测阳性而基因检测阴性的患儿，进行一代测序寻找有无新的突变位点。

1.3.3 G6PD缺乏症致病性变异分类标准根据相关表型，将G6PD缺乏症的致病性变异分为Ⅰ~Ⅳ类：Ⅰ类致病性变异导致酶活性严重缺乏（酶活性＜正常值下限10%）伴先天性非球形细胞溶血性贫血；Ⅱ类致病性变异导致酶活性严重缺乏（酶活性＜正常值下限10%）；Ⅲ类致病性变异导致酶活性轻中度缺乏（酶活性为正常值下限的10%~60%）；Ⅳ类致病性变异导致酶活性轻度降低或正常（酶活性为正常值下限的60%~150%）[1]。本中心酶活性正常值为男性≥2.8 U/g Hb，女性≥3.3 U/g Hb。

1.4 统计学分析

采用SPSS 22.0统计软件对数据进行统计学分析。计数资料采用频数及率（%）表示，组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法；采用Cochran‐Armitage趋势检验分析G6PD发病率与出生年份是否存在线性关系；多组基因突变位点致病性分类情况比较采用Kruskal‐WallisH检验；P＜0.05为差异有统计学意义。进一步两两比较则采取Bonferroni法，调整检验水准，P＜0.0167为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 成都地区早产儿G6PD缺乏症筛查结果

2015年1月1日至2019年12月31日成都市活产早产儿共计54 188例，进行G6PD缺乏症筛查54 025例，筛查率99.70%。检出可疑阳性患儿299例，初筛阳性率为5.53‰（299/54 025），其中男262例，女37例。召回213例，召回率71.2%（213/299），其中男192例，女21例。确诊G6PD缺乏症患者192例，发病率为3.55‰（192/54 025），其中男178例，女14例，男女比例为12.7 : 1。21例复查结果正常，阳性预测值90.1%（192/213）。通过诊断性酶活性检测法确诊患儿112例，通过基因诊断法确诊患儿80例。比较不同性别患儿采用不同检测方法的确诊符合率，发现女性患儿采用基因检测法的确诊符合率高于酶活性检测法（P=0.016），但对于男性患儿而言无差异（P＞0.05）。见表1。

表1 不同性别不同检测方法确诊符合情况比较[%（n/N）]

2.2 早产儿G6PD缺乏症发病情况

2015~2019年，成都市早产儿G6PD缺乏症发病率为3.55‰（192/54 025），高于同期筛查的足月儿（筛查881 749例，确诊2 682例，发病率3.04‰），差异有统计学意义（χ2=4.362，P=0.037）。2015~2019年，每年早产儿G6PD缺乏症的发病率分别为1.88‰（16/8 494）、3.75‰（45/12 004）、3.39‰（39/11 514）、3.50‰（38/10 847）、4.84‰（54/11 166）。采用Cochran‐Armitage趋势检验比较发现成都市早产儿G6PD缺乏症发病率有逐年增高的趋势（χ2=5.816，P=0.040）。

2.3 季节、胎龄和出生体重对G6PD缺乏症初筛阳性率的影响

夏季出生（6~8月）的早产儿初筛假阳性率为19.4%（13/67），高于其他3个季节出生的早产儿（5.5%，8/146），差异有统计学意义（χ2=8.513，P=0.004）；但夏季出生的早产儿G6PD缺乏症发病率（4.07‰，54/13 283）与其他3个季节出生的早产儿发病率（3.39‰，138/40 742）比较差异无统计学意义（χ2=1.117，P=0.291）。

对春、秋、冬季出生40 742例早产儿按出生胎龄不同分为胎龄＜32周组和胎龄≥32周组；按出生体重（birth weight, BW）不同分为BW＜2 500 g组和BW≥2 500 g组。比较其初筛假阳性发生情况及确诊情况可见：胎龄＜32周早产儿初筛假阳性率为33.3%（3/9），高于胎龄≥32周早产儿（3.6%，5/137），差异有统计学意义（χ2=9.208，P=0.002）；胎龄＜32周早产儿发病率为3.40‰（6/1 764），胎龄≥32周早产儿发病率为3.39‰（132/38 978），差异无统计学意义（χ2=0.000，P=0.994）。BW＜2 500 g组初筛假阳性率为12%（7/57），高于BW≥2 500 g组（1%，1/89），差 异 有 统 计 学 意 义（χ2=6.336，P=0.012）；BW＜2 500 g组的发病率（2.70‰，50/18 550）低于BW≥2 500 g组（3.97‰，88/22 192），差异有统计学意义（χ2=4.828，P=0.028）。胎龄＜32周且BW＜2 500 g组的初筛假阳性率及发病率数据与胎龄＜32周组完全一致，故未再进行胎龄联合BW的分组比较。

2.4 成都地区早产儿G6PD缺乏症基因突变分布情况及临床表现

87例初筛阳性患儿进行基因检测（男75例，女12例），其中80例检出基因突变（男69例，女11例），7例未检测出基因突变（男6例，女1例）。共检出9种基因突变：c.1388G＞A、c.1376G＞T、c.1024C＞T、c.871G＞A、c.1360C＞T、c.392G＞T、c.487G＞A、c.95A＞G、c.517T＞C。未检出复合杂合突变，女性患儿未检出纯合突变。检出率最高的前3种基因突变类型为：c.1388G＞A 26例（32%），c.1376G＞T 21例（26%），c.1024C＞T 13例（16%），共占比75%（60/80）。对初筛阳性而基因检测阴性的7名患儿，进行一代测序，均未发现新的突变位点。

根据G6PD致病性变异分类标准，不同的基因位点在女性患儿中均表现为Ⅳ类致病性变异；在男性患儿中表现为不同的致病性变异分类，93%（64/69）的致病性变异为Ⅲ~Ⅳ类，酶活性表现为轻中度缺乏（表2）。对检出率最高的前3位基因突变类型（c.1388G＞A、c.1376G＞T、c.1024C＞T）致病性分类情况进行 Kruskal‐WallisH检验，发现三者对酶活性的影响差异有统计学意义（P＜0.001）。进一步两两比较，c.1024C＞T与 c.1376G＞T，c.1024C＞T 与 c.1388G＞A 的 致 病性分类情况差异有统计学意义（P＜0.0167），提示c.1376G＞T与c.1388G＞A对酶活性的影响大于c.1024C＞T对酶活性的影响。c.1376G＞T与c.1388G＞A的致病性分类情况差异无统计学意义（P＞0.0167）。见表3。

对87例进行基因诊断患儿进行新生儿期病史询问，5例患儿因黄疸程度重住院治疗（1例为基因检测阴性患儿，4例为基因检测阳性患儿），入院时血间接胆红素为282~342 μmol/L（正常值范围：＜21 μmol/L），其中2例（均为男性，基因检测阳性）收集到住院期间血红蛋白数据，分别为148 g/L和135 g/L（正常值范围：140~170 g/L），均住院5~7 d治愈出院。

表2 男性患儿不同基因突变类型对应致病性变异分类情况 （例）

表3 检出率最高的前3位基因突变类型致病性情况比较[例（%）]

3 讨论

G6PD缺乏症是由于红细胞膜的G6PD缺陷，导致红细胞戊糖磷酸途径中谷胱甘肽还原酶的辅酶—还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸生成减少，使得维持红细胞膜稳定性的还原型谷胱甘肽生成减少而不能抵抗氧化损伤，它最终导致红细胞破坏并溶血的一种遗传病[3]。它是人类最常见的遗传性酶缺陷疾病之一，全球有数亿人受到该病影响[4]。该病在我国各地的发病率不尽相同[5‐7]，总体呈现出南高北低的规律。四川地区G6PD缺乏症的发病率为1.2‰[8]，属于相对低发区域。但本次研究发现成都市早产儿人群的发病率为3.55‰，明显高于四川地区总的发病率。可能与G6PD对胚胎早期的生物合成具有不可或缺的作用有关[9]，通过影响有核细胞的病理生理过程，包括调节细胞增殖、加速细胞衰老、增强细胞对病毒感染的敏感性等损害胚胎发育。另外成都市作为四川省省会，人口流动大也可使本地发病率出现增高趋势。G6PD缺乏症重在预防，新生儿疾病筛查是全世界公认的早发现、早诊断该病的重要方式。与成都市新生儿疾病筛查的先天性甲状腺功能减低症和苯丙酮尿症的发病率相比（前者为1/2 808，后者为1/22 397[10]），G6PD缺乏症仍是本地高发病种之一，新生儿筛查意义重大。

本次研究发现夏季出生、胎龄＜32周及BW＜2 500 g可能造成初筛假阳性率升高。这一结果与多位研究者的结论相符[8,11]。G6PD活性易受温、湿度等环境因素影响，成都地区夏季高温、高湿的环境可使血片在采集、存储、运输等过程中，降低 G6PD 活性而造成筛查结果出现假阳性[12]。筛查机构进行血片采集和存储时均按照《新生儿疾病筛查管理办法》要求执行，但运输环节管理办法未做明文规定，故建议夏季在成都地区推广冷链运输筛查标本来减少假阳性率的发生。胎龄更小，BW更低的早产儿，出现早产儿并发症几率更大，可能存在因其他病因造成G6PD酶活性继发性异常，随着原发疾病的好转，G6PD酶活性也逐渐恢复正常。虽然因此造成这一群体的初筛假阳性率有所增高，但这符合新生儿疾病筛查应以高灵敏度为主的原则，且G6PD缺乏症确诊费用低廉，如果因此提高这一群体的筛查切值可能造成假阴性漏诊患儿，对患者家庭的伤害更大。

本次研究发现女性患儿基因检测的确诊符合率高于酶活性检测法。原因是G6PD缺乏症是一种X染色体连锁不完全显性的遗传性疾病，其在男女之间的遗传规律不同[13]。男性只有1条X染色体，只要该X染色体上有G6PD基因缺陷就会表现为G6PD酶活性显著缺乏，易被酶活性检测法检出。而女性有2条X染色体，其上均存在G6PD等位基因，故只有纯合子和双重杂合子[14]的女性临床表现为重度G6PD酶活性缺乏，可被酶活性检测法检出，杂合子仅表现为轻度G6PD酶活性缺乏，无法被检出而造成漏筛。虽然总的来说女性杂合子病情程度轻，但也有病例发展为严重的急性溶血性贫血[4]。故应尽量扩大在女性早产儿中进行基因检测的范围，提高女性杂合子的检出率。

本次研究发现成都地区早产儿人群最常见的3种基因突变类型为：c.1388G＞A、c.1376G＞T和c.1024C＞T，共占75%。与国内已报道的最常见的3种基因突变类型[1]（c.1388G＞A、c.1376G＞T和c.95A＞G）不同，c.95A＞G在成都地区并不常见。与宁夏回族[15]、广西瑶族[16]的主要基因突变类型也不同；但与四川地区[8]地理位置比较接近的云南、贵州[17]报道一致。说明不同地区和民族的G6PD基因突变类型和发生频率不尽相同，而同一地区人群致病基因分布情况相似。不同的基因突变类型可致G6PD酶活性不同程度缺乏[18‐19]，对应不同的致病性变异分类。本次研究发现3种检出率最高的基因突变对应的致病性均比Minucci等[18]报道的基因突变库中相应基因突变的致病性要低，提示同样的基因突变在早产儿群体表现为更高的G6PD酶活性，这与其他学者报道的孕周越小G6PD酶活性越高相符[8,20]。也可能与本次研究样本数较小，研究对象地区差异有关，需收集更多早产儿样本进一步研究。

综上所述，成都市早产儿G6PD筛查覆盖率已达99%以上，该人群筛查的阳性预测值达到90%以上，可筛查出绝大部分早产儿G6PD患者，对于患儿的早期诊断和有效干预意义重大。可在夏季要求筛查机构使用冷链运输标本降低G6PD筛查的假阳性率,并逐步扩大女性早产儿基因检测比例来使成都市早产儿G6PD筛查工作更加科学。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。