不同产地前胡对氧化应激后支气管平滑肌细胞增殖影响研究*

周 洁 徐 攀 胡轶娟 楼柯浪 吴晓俊 梁卫青 张宏建 浦锦宝#

1 浙江省中医药研究院 浙江 杭州 310007

2 浙江中医药大学 浙江 杭州 310053

前胡为伞形科植物白花前胡Peucedanum praeruptorum Dunn的干燥根。主要分布安徽、浙江、贵州、云南、四川等地。《本草汇言》一书[1]中提到，“前胡，散风寒、净表邪、温肺气、消痰嗽之药也。如伤风之证，咳嗽痰喘，声重气盛，此邪在肺经也。”而据《本草纲目》记载，前胡“清肺热，化痰热，散风邪”[2]。现代药理学研究发现其具有降气化痰，宣散风热的功效，可用于肺气不降所致的痰热喘满，咯痰黄稠，风热咳嗽痰多。前胡在临床上治疗气道炎症有较好的疗效[3]，但其对H2O2处理氧化应激刺激下增殖影响未见文献报道。

氧化应激与气道炎症关系密切，气道炎症能促进气道重塑，而气道重塑中，气道平滑肌细胞的增生有着重要的作用[4]。研究表明，氧化应激可刺激支气管平滑肌细胞（HBSMSCs）增殖，进而导致气道炎症的发生和加重[5-6]。H2O2是一种体内氧自由基，属于活性氧家族成员之一。利用不同浓度H2O2刺激离体HBSMSCs的方法能近似地模拟自然状态下气道炎症的氧化应激状态[7]。气道炎症与氧化应激反应关系密切，氧自由基可激活NF-κB及某些细胞因子(如IL-8)等，对机体组织细胞产生氧化作用，这在气道炎症的发病机制中已得到广泛的认可[8]。

本研究在离体的人源支气管平滑肌细胞上，予不同浓度H2O2刺激不同时间的方法形成体外氧化应激模型。HBSMC经H2O2刺激后可以使细胞增殖率增加，由此可确定体外氧化应激模型造模成功。观察H2O2处理氧化应激刺激后，用前胡有效成分及不同产地前胡粗提物干预后支气管平滑肌细胞增殖影响。

1 仪器与试剂

1.1 试剂：RPMI-1640培养液、胎牛血清（Hyclone公司）；CCK-8、DMSO（Sigma公司）；0.25%胰蛋白酶EDTA、PBS缓冲液、1%青链霉素（Gibco公司）；10cm培养皿、96孔培养板（Corning公司）。

1.2 仪器：ELX800酶标仪（BioTek公司）；超净工作台（江苏省苏州净化设备公司）；CO2培养箱、-80℃超低温冰箱（Thermo公司）；倒置显微镜及数码摄像装置（Nikon公司）；4℃低温离心机（Eppendorf公司）。

1.3 样品采集：采集产于浙江（磐安、淳安、临安）、安徽、湖南、湖北、四川、云南、山东、江西、贵州、重庆等12地的白花前胡栽培新鲜药材，自然阴干后用于前胡药材有效成分含量（白花前胡甲素、乙素）的测定，样品信息见表1。

2 实验方法

2.1 细胞培养：购买人支气管平滑肌细胞HBSMCs复苏传代培养，2～8代细胞用于实验。于RPMI-1640培养液（含10%FBS）的10cm皿中正常传代培养，培养箱温度为37℃，CO2浓度为5%。

2.2 CCK-8检测细胞增殖：向96孔板中接种5000个细胞/孔，分别用不同浓度的供试品孵育细胞，再向每孔细胞中加入10μl CCK-8试剂，37℃生化培养箱继续孵育3h，最后利用酶标仪在450nm波长处测定细胞吸光度值来检测细胞增殖活力。

2.3 不同产地前胡提取物中白花前胡甲素和乙素含量的测定：称取不同产地前胡干燥粉末各0.5g，加入25ml甲醇超声提取30min，减压挥干后，再用DMSO分别溶解稀释前胡提取物至125、250、500μg/ml，测定12个产地中前胡提取物中白花前胡甲素和乙素的含量。

3 实验结果

3.1 不同产地前胡中白花前胡甲素和乙素含量：不同产地中前胡白花前胡甲素和乙素含量测定结果见下表1。从表中可知，各产地之间的白花前胡甲素和乙素含量有较大差异，分别在14.43～22.45mg/g和0.82～6.71mg/g之间。而根据国家药典规定白花前胡甲素和乙素含量不得低于0.9%和0.24%，所有产地前胡中白花前胡甲素含量均超过药典标准，部分产地的白花前胡乙素含量达不到药典标准。其中野生前胡提取物中的白花前胡乙素含量远大于栽培前胡提取物的含量。

表1 不同产地前胡提取物中白花前胡甲素和白花前胡乙素含量

3.2 不同浓度H2O2作用不同时间下细胞增殖率CCK-8变化：如图1所示，可观察到在25、50μM浓度范围内，作用6h、12h后，0、25、50、100μM浓度H2O2作用组吸光度均无明显差别；作用24h后，25、50μM浓度H2O2组吸光度较0μM高，在25μM H2O2作用24h时，吸光度值达到最大，增殖率最大。作用48h、72h后，25μM、50μM浓度H2O2组吸光度值仍较0μM浓度H2O2组高，50μM浓度H2O2组吸光度值较25μM浓度H2O2组为低。在200μM浓度H2O2作用6h后，细胞增殖率就开始负增长，且随着作用时间延长，负增长率逐渐增大。

图1 不同浓度作用HBSMC不同时间下细胞增殖率检测

3.3 前胡中白花前胡甲素、白花前胡乙素对H2O2诱导支气管平滑肌增殖的影响：向96孔板中接种2000个细胞/孔，据图1中25μM H2O2作用24h细胞增值率最大作为对照，分别用不同浓度白花前胡甲素、白花前胡乙素分别进行干预，24h后每孔加入10μlCCK-8在酶标仪中450nm处检测吸光值。

如图2所示，白花前胡甲素在12.5、25、50μM浓度下对H2O2刺激HBSMSCs增殖有较明显的抑制作用，且与空白对照0μM相比，差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.001）。而白花前胡乙素对H2O2刺激HBSMSCs增殖的抑制作用较弱，其中12.5、25μM白花前胡乙素与0μM相比有一定的抑制作用，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

图2 经H2O2刺激后白花前胡甲素、白花前胡乙素对HBSMSCs增殖影响

3.4 不同产地前胡对H2O2诱导支气管平滑肌增殖的影响：本实验组选取表1中白花前胡。于96孔板中接种HBSMSCs，加入25μMH2O2后分别用上述不同产地不同浓度白花前胡提取物进行干预后，加入CCK-8试剂孵育后放入酶标仪（450nm）进行检测。

如图3所示，与control组相比，1～12不同产地供试品在125μg/mL浓度下对H2O2诱发的HBSMSCs增殖效应均有抑制，且差异均有统计学意义。其中1、2、3、8四个产地来源的白花前胡粗提物在125μg/ml抑制H2O2诱发的HBSMSCs增殖的效果较其他产地更佳（P＜0.001）。其次4、6、7、10在125μg/ml抑制H2O2诱发的HBSMSCs增殖的效果较control组相比，差异有统计学意义（P＜0.01）。而5、9、11、12四个产地的白花前胡提取物在抑制H2O2诱发的HBSMSCs增殖效果上较control组相比，差异有统计学意义（P＜0.01），但较其他8个产地效果稍差。随浓度增高，1～12白花前胡抑制作用均较125μg/ml浓度减弱，其中1、8与control组相比，差异有统计学意义（P＜0.001）。其次为3与control组相比，差异有统计学意义（P＜0.01）。此外，2、12与control组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图3 不同产地前胡对H2O2诱导支气管平滑肌增殖的影响

3.5 不同产地前胡提取物抑制平滑肌细胞增殖活性与其活性成分含量的相关性分析：在测定不同产地前胡提取物中白花前胡甲素和白花前胡乙素的含量及其对平滑肌细胞增殖抑制活性的基础上，本研究还对两者进行了Person相关性分析（表2）。从表中相关系数来看，3种给药浓度下白花前胡甲素与抑制平滑肌细胞增殖活性的相关系数均大于白花前胡乙素与抑制平滑肌细胞增殖活性的相关系数，这也与本研究中白花前胡甲素单体和白花前胡乙素单体对平滑肌细胞增殖活性的抑制作用一致。

表2 不同产地前胡提取物抑制平滑肌细胞增殖活性与活性成分含量相关系数

4 讨论

在不同浓度H2O2作用HBSMSCs不同时间考察中，25μM H2O2作用24h时，增殖率最大。白花前胡甲素在12.5、25、50μM浓度下对H2O2刺激HBSMSCs增殖有较明显的抑制作用。而白花前胡乙素对H2O2刺激HBSMSCs增殖的抑制作用较弱，其中12.5、25μM白花前胡乙素与0μM相比有一定的抑制作用，但差异无统计学意义。由此可得，在HBSMSCs氧化应激引发的增殖过程中，白花前胡甲素相较于白花前胡乙素其抑制作用较为明显。

本实验比较不同产地前胡对H2O2刺激HBSMSCs增殖抑制效果，发现来自浙江三个产地和安徽宁国四个产地的抑制作用最强，其次为贵州大方、江西九江、湖北利川和云南腾冲，而湖南华容、山东泰安、重庆巫溪和四川达州效果稍差。这也说明了产自道地产区浙江和安徽的前胡药材对于支气管平滑肌细胞增殖有较好的抑制作用，具有较好的消除气道炎症的效果。

抑制平滑肌细胞增殖活性与前胡活性成分含量的相关性分析表明，前胡提取物抑制平滑肌细胞增殖活性与其活性成分白花前胡甲素和白花前胡乙素含量均呈正相关，与白花前胡乙素相比，白花前胡甲素与抑制平滑肌细胞增殖活性的相关性更强。

本研究立足本草经典，与现代药理研究结合，挖掘前胡在氧化应激条件下对气道炎症的药理作用，并通过不同产区前胡抗气道炎症活性比较，得出道地产区浙江和安徽两地的前胡药材较其他产区效果更佳，且相关性分析得出该生物学效应与其活性成分前胡甲素、乙素含量呈正相关，该研究还为我国中医理论现代化的发展提供有益的参考。