多肋藻雌配子体种质保存和扩培的温光条件研究

赛珊，赵楠，罗世菊，王伟伟，武瑞娜，李晓捷

（山东东方海洋科技股份有限公司，国家海藻与海参工程技术研究中心，山东省海藻与海参技术创新中心，山东省海藻遗传育种与栽培技术重点实验室，山东 烟台 264003）

多肋藻（Costaria costata）是一种一年生的大型褐藻，属海带目，海带科，多肋藻属。自然分布于太平洋北部沿岸潮间带或潮下带浅海区，其中日本北海道，朝鲜半岛以及俄罗斯远东部分地区均有分布[1-4]。多肋藻是一种经济褐藻，通常用作海参、鲍鱼等海珍品的饲料。近些年来，研究者发现从多肋藻中提取出的多肋藻多糖，具有调节血脂的作用，能抑制血清中总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白的升高[5-6]，多肋藻已成为海藻养殖的热点种类之一。目前，多肋藻的繁育主要是利用常温人工育苗和配子体克隆育苗2 种方式[7-8，10-11]。孙娟等[9]对多肋藻雌、雄配子体的研究发现雄配子体在不同温度和光照条件下抗逆性较强，而雌配子体在强光照条件下易出现死亡现象。现选多肋藻雌配子体为材料，摸索其适宜的种质保存和扩增培养的温度和光照条件。

1 研究方法

1.1 试验材料

实验室种质库保存的生长状态良好的多肋藻雌配子体克隆系。培养液为加热煮沸的过滤海水，添加ρ（NaNO3-N）为10 mg/L，ρ（KH2PO4-P）为1 mg/L。

1.2 试验方法

（1）材料预处理。将多肋藻克隆系用循环泵气动打散，其滤液经400 目筛绢过滤，取适量滤液于直径为9 cm 培养皿中。在显微镜（10×10 倍）下镜检打散的丝状体，平均每段为3～4 个细胞、每个视野有4～5 个配子体段为宜。培养皿放置在低温弱光[10 ℃，≤2 μmol/（m2·s）]条件下静置一周使丝状体段附着便于计数。

（2）方法。设置3 个温度，分别为10、15 和20 ℃，每个温度下设5 个光照强度，分别为10、20、40、60和80 μmol/（m2·s），共15 个试验组；每个试验组设3 个平行。试验进行了4 个月，前13 d 每3 d 镜检一次，统计丝状体段细胞数。13 d 后每5 d 镜检一次，拍照并观测配子体生长状态。根据初始丝状体细胞数（N0）和试验结束时丝状体细胞数（N1），按照公式RGR=100×[ln（N1）-ln（N0）]/t 计算相对生长速率，其中，t 为试验天数（d）。

2 结果分析

2.1 试验前期（1—25 d）配子体的生长状态

（1）丝状体段细胞增长数统计。试验前13 d 进行了细胞计数，结果见图1（a）（b）（c）。

图1 10、15、20 ℃时配子体生长状态

（2）配子体生长状态的观察。在10 ℃条件下，丝状体细胞偏粗，见图2（a）。10～40 μmol/（m2·s）时状态较好；60 μmol/（m2·s）时出现细胞色素不均匀的现象；80 μmol/（m2·s）时出现细胞形态不规则，色素粒状现象。15～20 ℃条件下，光照强度为10～40 μmol/（m2·s）时配子体生长较快且枝条伸展，色素鲜亮，见图2（b）；60～80 μmol/（m2·s）时部分细胞出现色泽暗淡、色素降解现象，见图2（c）；甚至部分细胞出现色素空、死亡现象，见图2（d）。

2.2 试验中期（26—50 d）配子体的生长状态

试验第26—38 d，10～20 ℃，10～20 μmol/（m2·s）条件下配子体状态良好，温度为15 ℃时，生长尤其旺盛，分枝体复杂交错，见图3（a）。10～15 ℃，40～60 μmol/（m2·s）时色素较淡，少部分色素空，见图3（b）；20 ℃，40～60 μmol/（m2·s）时枝条不舒展，细胞发圆较明显，见图3（c）；10～20 ℃，80 μmol/（m2·s）时配子体生长状态较差，色素降解明显，但丝状体上长出状态良好的新分枝，见图3（d）。

第38—50 d，10～20 ℃，10～80 μmol/（m2·s）条件下的配子体均进入营养生长期。10～20 μmol/（m2·s）时配子体状态依然良好；40 μmol/（m2·s）时状态较好，细胞色素淡、伸展，见图4（a）；60～80 μmol/（m2·s）时长出新的分枝体，虽然部分细胞形态偏圆，色素偏暗，但分枝体有生长且舒展，见图4（b）。

图2 试验前期配子体生长状态

图3 试验中期（26—38 d）配子体生长状态

2.3 试验后期（50—120 d）配子体的生长状态

第50—80 天，10 ℃，10～80 μmol/（m2·s）时配子体同中期（38—60 d）时变化不明显，依然正常生长。15 ℃，10～40 μmol/（m2·s）时配子体状态良好，但生长变慢；60～80 μmol/（m2·s）时细胞形态不规则，有色素降解现象。20 ℃，10～20 μmol/（m2·s）时配子体个别细胞出现膨大，色素淡的情况；40 μmol/（m2·s）时出现细胞色素不均匀，粒状现象；60～80 μmol/（m2·s）时出现少数细胞死亡现象。

图4 试验中期（38—50 d）配子体生长状态

第80—120 天，10 ℃，10～40 μmol/（m2·s）时配子体状态良好，依旧枝条伸展、色素鲜亮，见图5（a）；60～80 μmol/（m2·s）时部分细胞色素偏淡但分枝体舒展，见图5（b）。15 ℃，10～20 μmol/（m2·s）时配子体部分细胞发圆，色素不均匀，见图6（a）；40 μmol/（m2·s）时配子体细胞色素降解较明显；60～80 μmol/（m2·s）时分枝体不伸展，半数细胞色素空、死亡，见图6（b）；20 ℃，10～20 μmol/（m2·s）时配子体状态较差，色素降解、空，部分细胞膨大，见图7（a）；40 ～60 μmol/（m2·s）时开始出现死亡细胞；80 μmol/（m2·s）时基本全部死亡，见图7（b）。

图5 试验后期（80—120 d）10 ℃时配子体的生长状态

图6 试验后期（80—120 d）15 ℃时配子体的生长状态

图7 试验后期（80—120 d）20 ℃时配子体的生长状态

3 讨论

试验结束时，温度为10 ℃，光照强度为10 μmol/（m2·s）时配子体状态比其他试验组都好，得出在低温低光照时适宜配子体种质保存。

光照强度在60～80 μmol/（m2·s）时，在试验前期丝状体状态差，部分细胞甚至死亡，在实验中期这些状态差的丝状体上又长出新的枝条舒展的分枝体，在试验后期配子体在温度越高时生长状态变差越明显。分析认为配子体对生存环境有一定的抗逆性，但光照强度超过60 μmol/（m2·s）时并不适宜长期培养配子体。

孙娟等[9]研究发现，雌配子体在光照强度超过40 μmol/（m2·s）时就出现萎缩衰退死亡，这和该研究前期结果一致；试验后期，在10 ℃条件下，光照强度超过40 μmol/（m2·s）时配子体状态也较好，分析认为孙娟等[9]试验进行了4 周，该研究持续进行4个月，培养时间不同配子体最终生长状态也不同。孙娟等[9]研究发现在20 ℃，20 μmol/（m2·s）时雌配子体生长速度最快，研究前期在15 和20 ℃，20 μmol/（m2·s）时生长速度快，而在试验后期20 ℃，20 μmol/（m2·s）条件下配子体出现色素空、死亡现象。说明配子体并不适宜在高温下进行长期培养。

4 结论

多肋藻雌配子体在温度越高、光照越强时状态越差，并不适宜在高温和强光下进行长期培养。配子体在温度为10 ℃，光照强度≤10 μmol/（m2·s）时适宜种质保存；15～20 ℃，20 μmol/（m2·s）时适宜短期扩增培养；15 ℃，20 μmol/（m2·s）时适宜长期扩增培养。