E.coli对藏羊EECs相关凋亡因子表达的影响

王立斌，张兴云，王 萌，潘阳阳，胡学权，韩金辉， 马进彪，马文斌，徐庚全，樊江峰，余四九

(甘肃农业大学 动物医学院，甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心，兰州 730070)

藏羊是中国绵羊三大品系(蒙古系、藏羊系和哈萨克绵羊系)之一，是青藏高原农牧民重要的生产和生活资料，对该地区的经济发展具有极其重要的作用[1-3]。长期以来，由于粗放的养殖模式和落后的管理水平，藏羊在分娩及流产后很容易受到E.coli和金黄色葡萄球菌(S.aureus)的感染[4-7]，使子宫内膜炎的发病率保持较高水平，严重地影响了藏羊的繁殖能力，甚至造成死亡，给当地的经济发展和人民的生活水平带来了很大的影响[8]。研究其子宫内膜上皮细胞感染后相关凋亡因子的表达规律，对及早诊断和防治该病的发生具有重要意义。

细胞凋亡又称为程序性细胞死亡，是细胞维持生命活动的重要过程。细胞凋亡对器官组织的生长发育、免疫、新陈代谢以及非正常细胞的清除具有重要意义[9-11]。而细胞凋亡的诱导与执行需要一系列蛋白分子信号的共同作用，如信号分子、受体、蛋白酶和基因等。已有的研究表明，Caspase-3是最为关键的细胞凋亡执行者,它在细胞凋亡的过程中发挥关键作用[12-16]。Caspase-3家族是直接导致凋亡细胞解体的蛋白酶系统，在细胞凋亡机制网络中居中心地位。一旦被激活，即发生下游的级联反应，使凋亡不可避免[17-18]。Bcl-2蛋白家族是一类凋亡调控蛋白质[19-20]，它是细胞凋亡的抑制基因，与Bax共属于Bcl-2蛋白家族。而Bax蛋白不仅拮抗Bcl-2的抑制凋亡作用，还具有进一步促进细胞凋亡的功能[21-23]。在通过线粒体应激诱导的细胞凋亡中Bax起关键作用。Bax大多以单体形式定位于胞浆中，少部分定位于EP等细胞器中。单体Bax不能刺激细胞色素c的释放，Bax可以形成寡聚体，从细胞浆中转移到线粒体膜上，和Bcl-2形成多聚体，增强线粒体的通透性，最后导致细胞色素c释放。另一方面，Bax低聚物在外膜插入形成通道，释放Ca2+，对Bax有协同作用。以及后续的Caspase-9激活，Caspase蛋白酶家族的酶解级联激活等，最终导致细胞凋亡[24-25]。

本试验拟通过酶消化法分离培养藏羊EECs，用不同MOI的E.coli感染EECs后，采用流式细胞术检测EECs的凋亡率，用qRT-PCR及WesternBlot在基因和蛋白水平上检测Caspase-3、Bcl-2、Bax等凋亡因子在EECs上的表达，为揭示感染后细胞的凋亡过程和子宫内膜炎的发病机理提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器设备

细胞培养箱(Thermo Forma3110，美国)，荧光倒置相差显微镜(CK41，Olympus，日本)，流式细胞仪(Cytomics FC 500MCL，美国)，qRT-PCR仪(LightCycler 96，德国)。

1.2 主要试剂

DMEM/F12基础培养液(12400-016)、胎牛血清FBS(10099-141)；EGF；青霉素和链霉素(Gibco)；胰蛋白酶(Sigma)；YF488A-AnnexinV和(Propidium Iodide，PI)细胞凋亡检测试剂盒(US EVERBRIGHTINC)；高效RIPA组织/细胞裂解液、4×蛋白上样缓冲液(Solarbio)；Caspase-3(bs-0081R)、Bcl-2(bs-4563R)、Bax(bs-0127R)多克隆兔抗(Bioss)。

1.3 藏羊EECs培养与鉴定

采集青海省西宁市某屠宰场空怀期健康藏羊子宫10副，参考马欣等[26]对绵羊子宫内膜上皮细胞的纯化培养方法，样品用含双抗生理盐水冲洗，将子宫内膜与肌肉组织分离，剪成细小组织块，并用0.2%胶原酶Ⅰ消化，37 ℃震荡水浴。过筛后离心获取EECs，用添加50 ng/mLEGF的完全培养基DMEM(20%FBS(体积分数))进行原代培养，用0.25%胰蛋白酶(含EDTA)将其消化纯化；采用细胞免疫荧光方法检测波形蛋白和角蛋白18在EECs上的表达。

1.4 检测细胞凋亡

1.4.1E.coli感染藏羊EECs试验 将细胞调整密度后接种在6孔板，在5% CO2下，37 ℃培养至对数生长期，PBS清洗后取3孔计数并取平均值；设置不同的MOI进行大肠杆菌感染试验,即设空白对照组、1∶1组、5∶1组、10∶1组、 20∶1组、50∶1组共6组试验模型(MOI为细菌数：细胞数)，每孔各加2 mL基础培养液，并按所设MOI加入相应体积大肠杆菌；37 ℃感染培养 3 h。

1.4.2 流式细胞仪检测细胞凋亡 各组细胞经上述步骤感染3 h后用0.25%胰蛋白酶(不含EDTA)对细胞进行消化，预冷的PBS洗涤细胞2次后，用结合缓冲液重悬细胞，各加入5 μL YF488-AnnexinV和PI工作液，混合后室温避光孵育15 min，加入400 μL结合缓冲液于流式细胞仪测定各试验组细胞发生凋亡的比例。

1.5 细胞总RNA提取与反转录

提取感染细胞总RNA，并反转录成cDNA；反应体系(20 μL)：ddH2O 7 μL，5×gDNA digester Buffer 2 μL，gDNA digester1 μL，模板RNA1 μL，42 ℃孵育2 min，再加10 μL 2×HonorIISuperMixplus。反应条件：25 ℃ 5 min， 42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃保存。

1.6 引物设计

在GenBank数据库中检索羊Caspase-3、Bcl-2、Bax和β-actin基因序列，用Primer Premier 6.0软件设计引物，由上海生工基因公司合成，引物序列见表1。

表1 试验所用引物Table 1 Primers used in thistest

1.7 qRT-PCR检测 Caspase-3、 Bcl-2和Bax的基因表达水平

通过qRT-PCR检测Caspase-3、Bcl-2和Bax的基因表达，β-actin为内参基因，反应体系(20 μL)：TB Green Premix ExTaqⅡ 10 μL，上下游引物各0.8 μL，ddH2O 6.4 μL，cDNA模板2 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环，每个样品按基因设4个重复组，试验重复3次。通过2-△△Ct方法可得出上述基因的相对表达量并绘图。使用SPSS 25软件对数据进行分析。

1.8 Western Blot检测Caspase-3、Bcl-2和Bax的蛋白表达水平

EECs感染3 h后，冰上对EECs进行裂解，10 min后收集；将裂解后的样品10 000～14 000 g离心3～5 min，取上清；获得的蛋白质样品与 4×蛋白上样缓冲液按3∶1混合后于100 ℃条件下煮10 min对蛋白进行变性处理，加至10% SDS-PAGE凝胶样品孔内进行电泳分离(浓缩胶电压为70 V，分离胶电压为110 V)，将分离的蛋白质转移至PVDF膜上(转膜条件：电流100 mA，时间60 min)，用5%脱脂奶粉室温封闭2 h，在含Caspase-3、Bcl-2、Bax和β-actin抗体反应液中4 ℃孵育过夜，室温条件下二抗孵育1 h，洗膜后加入化学发光液于成像仪中进行显影。利用Image J对蛋白表达情况进行定量分析。

2 结果与分析

2.1 藏羊EECs培养与鉴定

培养获得原代细胞(图1-A)、纯化后第3代(图1-B)及第6代细胞(图1-C)均长势良好，呈鹅卵石样生长；细胞免疫荧光方法检测显示，PBS和波形蛋白在上皮细胞质上不表达，呈阴性(图2-A、B)，角蛋白18在上皮细胞中特异性表达，细胞质被染成红色，呈阳性(图2-C)。鉴定显示，仅有极少成纤维细胞出现，藏羊EECs纯度达到98%，可用于后续试验。

2.2 流式细胞仪检测细胞凋亡

经E.coli感染藏羊EECs 3 h后，各感染组的凋亡率逐步增加，与对照组相比均差异显著 (P<0.05)；对照组凋亡率为0.3%，MOI为 50∶1时，凋亡率为89%，达到最高；同时，随着凋亡细胞的增加，活细胞数逐渐减少(图3和图4)。

2.3 qRT-PCR检测 Caspase-3、 Bcl-2和Bax基因的表达

通过qRT-PCR方法测定Caspase-3、Bcl-2、Bax基因的相对表达量，其结果如图5、6、7所示；不同MOI下，各因子基因表达存在差异性，经E.coli感染藏羊EECs 3 h后，与对照组相比，当MOI为1∶1时，Caspase-3和Bax基因的相对表达量升高不明显(P>0.05)，但Bcl-2基因的相对表达量达到最高(P<0.05)；随着MOI增加，除Bcl-2基因外，Caspase-3和Bax基因的相对表达量逐步增加，当MOI为20∶1时，Bax基因的相对表达量达到最高(P<0.05)；当MOI为 50∶1时，Caspase-3基因的相对表达量达到最高(P<0.05)，而Bcl-2基因的相对表达量最低 (P>0.05)。

2.4 Western Blot检测 Caspase-3、 Bcl-2和Bax基因的表达

Western Blot方法测定Caspase-3、Bcl-2和Bax基因的表达量，其结果如图8、9、10、11所示；Caspase-3、Bcl-2和Bax基因在蛋白合成过程中与其基因的相对表达量成正相关，即经E.coli感染藏羊EECs 3 h后，当MOI为1∶1时，Caspase-3和Bax基因的蛋白表达与空白组相比较低(P>0.05)，但Bcl-2基因的蛋白表达达到最高(P<0.05)；随着MOI增加，除Bcl-2基因外，其余各基因的蛋白表达量逐步增加，当MOI为20∶1时，Bax基因的蛋白表达达到最高(P< 0.05)；当MOI为50∶1时，Caspase-3基因的蛋白含量达到最高(P<0.05)，而Bcl-2基因的蛋白含量最低(P>0.05)。

3 讨 论

3.1 藏羊EECs体外分离培养

研究表明，EGF对细胞生长的影响具有物种差异性和剂量依赖性[27-30]，低剂量EGF可促进增殖，而高剂量EGF可诱导细胞周期停滞和凋亡[31]。本试验通过酶消化法对藏羊EECs进行体外培养，并在培养基中添加50 ng/mL EGF。王伟[32]用0.25%胶原酶Ⅰ在37 ℃水浴消化奶牛子宫上皮组织3～4 h，得到了98%纯度的EECs；马欣等[26]用0.1%胶原酶Ⅰ在37 ℃消化绵羊子宫上皮组织6 h，得到了70%纯度的EECs。本试验则采用0.2%胶原酶Ⅰ 37 ℃震荡水浴消化 6 h，依次过100目、200目、400目细胞筛后可得到所需的上皮细胞团，但纯度稍低；同时用全培反冲400目过滤筛后可得到纯度较高的上皮细胞团。试验中在培养基中添加了50 ng/mL EGF，从原代细胞开始，细胞表现出良好的生长状态，细胞用0.25%胰蛋白酶利用差速消化法进行纯化，只需30 s即可去除成纤维细胞，90～120 s可使所有细胞变圆漂浮，培养时贴壁情况也很好，可在 3～4次将成纤维细胞以及其他杂细胞快速去除干净，经鉴定可获得纯度在98%以上的藏羊EECs，获得的细胞可传至6代以上，并能用于后续试验，这也为构建藏羊子宫内膜体外模型奠定了基础。

3.2 Caspase-3、 Bcl-2和Bax的表达

细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种形式，可有序、高效地清除受损细胞，如 DNA 损伤或发育过程中造成的细胞凋亡。细胞凋亡可由来自细胞内的信号触发，如遗传毒性应激，或由外在信号触发，如配体与细胞表面死亡受体的结合[33]。赵凌[34]用不同浓度的S.aureus、E.coli对奶牛乳腺上皮细胞进行感染后发现，凋亡率随菌液浓度的增加而上升，本试验与其研究结果一致。细胞凋亡和坏死，这两个过程可以独立发生，也可以同时发生，流式细胞仪检测结果显示，细胞的死亡并不是单一因素造成的，细胞发生炎症反应时伴随着细胞的凋亡和坏死，炎症反应介导了细胞凋亡和坏死的发生，这对因细菌感染引起的子宫内膜炎机制有了更进一步的解释，对下一步如何防治子宫内膜炎有重要意义。

Caspase-3、Bcl-2、Bax是细胞凋亡的重要信号通路之一，其中Caspase激活是启动凋亡的关键因素。细胞遭受损伤或在伤害性因子刺激下，其线粒体外膜被破坏，通透性增加，导致Cyt-C释放进入胞质，与Caspase-9凋亡蛋白激酶激活因子等相结合形成凋亡小体，激活Caspase-3，启动细胞凋亡，Caspase-3可激活特定信号系统，产生核皱缩、DNA片段形成等凋亡现象，最终导致细胞凋亡[35-36]。Nguyen等[37]证明Caspase-3的高表达和细胞凋亡密切相关。在细胞凋亡过程中，多种因子参与调控凋亡进程，抑凋亡因子(如Bcl-2、Bcl-xl及survivin等)抑制Caspase级联反应进而抑制凋亡。促凋亡因子(如Bax、Bak及Bid等)可激活Caspase级联反应诱导凋亡[38]。Bcl-2蛋白质家族之间的相互作用对细胞凋亡的调控起着重要作用，研究表明Bcl-2在神经元细胞的抗凋亡机制中起重要作用，朱旻宇等[39]证明Bcl-2表达可以强力抑制细胞凋亡并且增强细胞活性，Smerage等[40]通过向脊髓损伤大鼠转染Bcl-2基因的试验发现Bcl-2基因会转运到Clarke核神经元，从而减少细胞萎缩并防止细胞死亡，对细胞凋亡起到抑制作用，Bax基因则促进细胞凋亡进程。本试验结果表明，Caspase-3、Bcl-2、Bax基因的mRNA表达量与蛋白的表达量成正相关，Caspase-3和Bax的表达量随MOI的增大逐步升高，Bcl-2则逐步降低，与上述研究结果相似，EECs接种E.coli后，不仅能够引起EECs的局部感染以及形态变化，同时也能够引起EECs对凋亡因子在基因和蛋白水平上表达的变化。因此，上述各凋亡因子可作为识别藏羊子宫内膜炎病理程度的重要指标。

4 结 论

在培养液中加入50 ng/mL EGF后用酶消化法可以分离出培养出藏羊EECs，通过波形蛋白及角蛋白18免疫荧光鉴定，EECs纯度达到98%以上，为研究藏羊子宫内膜生殖生理机制提供体外细胞模型。不同MOI的E.coli感染后，藏羊EECs结构逐渐遭到破坏，且MOI越大，细胞凋亡越严重。Caspase-3和Bax的表达量随MOI的增大逐步升高，Bcl-2则逐步降低，这些因子可作为识别藏羊子宫内膜炎病理程度的重要指标。