甘加型藏羊发情周期血浆雌激素测定及HPO轴ERα的表达

包莹莹，陈卫刚，何玉琴，杨志杰，葛闻博，张 霞，周凯仁，杨大鹏

( 甘肃农业大学 生命科学技术学院，兰州 730070)

甘加型藏羊是甘南草地型藏羊中的优良地方类型之一，生活在2 800 m以上的高海拔地区，典型的季节性(7—9月)发情动物，发情周期平均为(16 ± 2)d，每年产羔1 次，1 次1 胎，繁殖率较低[1]。下丘脑-垂体-卵巢(HPO)轴对雌性哺乳动物的生殖活动发挥着重要的调控作用。雌激素主要由卵巢分泌，目前发现主要有雌酮(Estrone,E1)、雌二醇(17β-estradiol,E2)和雌三醇(Estriol，E3)，其中E2的含量最高且生理活性最强[2]。雌激素分泌后进入血液与性激素结合球蛋白、清蛋白可逆性结合，游离的雌激素也可随血液循环进入靶器官，与雌激素受体(Estrogen receptor,ER)结合后通过复杂的信号转导和转录调控过程，调节机体各个系统(如心血管系统、生殖系统和神经内分泌系统等)[2-3]的生理功能。ER是核受体蛋白超家族中的一种转录因子，它包括两种经典亚型ERα和ERβ[4]。研究表明，ERα是维持雌性动物HPO轴负反馈稳态的主要受体形式[5]。在哺乳动物中，雌激素协同卵泡刺激素(Follicle stimulating hormone,FSH)促进卵泡发育，诱导排卵前黄体生成素(Luteinizing hormone,LH)激增，从而触发排卵[6]。因此，雌激素及其受体的生理研究一直被国内外学者广泛关注。已有研究报道猪[7]、山羊[8]、牛[9]等动物发情周期内血浆雌激素的变化规律，ERα也被证明在大鼠[10]、双峰驼[11]、山羊[12]等哺乳动物生殖轴中均有表达。但有关甘加型藏羊发情周期内血浆雌激素变化规律及其受体表达分布的研究鲜见报道[13]。因此，本研究以甘加型藏羊为试验对象，运用ELISA检测其发情周期内血浆雌激素含量变化，运用RT-qPCR、Western blot及免疫组织化学染色法检测HPO组织中ERαmRNA及其蛋白的表达差异，探讨雌激素及其受体α对甘加型藏羊发情周期的影响，并为进一步研究生殖相关激素对藏羊繁殖的影响提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

试验于藏羊繁殖季节(7—9月)在甘肃省甘南州夏河县甘加乡某藏羊养殖场进行，选取32只年龄2.5～3.5岁的雌性健康且未孕的甘加型藏羊，根据公羊爬跨试情(公羊爬跨时记为0 h)，按照四期分法[14]，即发情前期(第14天早上～第16天晚上)、发情期(第0～36 小时)、发情后期(第39～72 h)及间情期(第4天早上～第13天晚上)分为4组，每组8只羊。发情期每2 h采血1次，发情后期每3 h采血1次，间情期和发情前期每天早(7：00)晚(19:00)各采血1次。每次肝素钠抗凝真空采血管颈静脉采血10 mL，3 000 r/min离心10 min，将上清转移到干净的血浆管中， -20 ℃冰箱保存，备用。检测判定下一个发情周期，分别在发情周期内 4 个时期的中间宰杀取样，即在发情期第12小时、发情后期第66 小时、间情期第9天和发情前期第15天处死试验羊后迅速采取下丘脑、垂体及卵巢组织，将组织等体积分为两半，一半放到体积分数为4%的多聚甲醛溶液中，一半迅速放入液氮中，转移至-80 ℃ 冰柜保存，备用。

1.2 血浆雌激素的测定

按ELISA试剂盒(奇松生物，北京)说明测定血浆中雌激素的OD值。根据标准品的OD值及相应浓度绘制标准曲线，得到回归方程y= 0.026 9x-0.105 5，其中y代表OD值，x代表雌激素含量。

1.3 HPO组织ERα mRNA检测

根据RNA提取试剂盒(TransGen，北京)说明书分别提取甘加型藏羊不同发情周期下丘脑、垂体和卵巢组织中总RNA，并按反转录试剂盒(TransGen，北京)说明书，以20 μL体系进行反转录，反转录合成的cDNA第一链-20 ℃ 保存，备用。

根据NCBI中已有的绵羊ERα和β-actinmRNA序列设计引物(Primer Premier 5.0)，引物由上海生工生物公司合成(表1)。以反转录的cDNA 为模板，按TranScriptTip Green qPCR SupperMix(TransGen，北京)20 μL总体系进行RT-qPCR。反应条件： 94 ℃预变性30 s； 94 ℃变性 5 s， 60 ℃退火30 s，进行45次循环；72 ℃延伸10 s。每个样品做3次重复。

表1 RT-qPCR引物Table 1 Primer of RT-qPCR

1.4 HPO组织ERα蛋白检测

分别将下丘脑、垂体及卵巢组织在低温条件下充分研磨后，各称取100 mg研磨液，加入蛋白裂解液(1 mL裂解液+10 μL蛋白酶抑制剂)(Bioss,北京)，冰上充分裂解后4 ℃ 、12 000 r/min离心5 min，取上清液，按体积比3∶1与 4×上样缓冲液混合，98 ℃水浴变性后-20 ℃保存，备用。

配制5%的浓缩胶和12%的分离胶，每孔加8 μL蛋白进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后对照Marker预染条带切取ERα(66 ku)、β-actin(42 ku)对应胶条，湿转法将凝胶上的蛋白转移到PVDF膜(Solarbio，北京)上；PBST(PBS + tween 20)(Bioss,北京)溶液洗膜后用50 g/L脱脂奶粉(Bioss,北京)封闭20 min；加ERα(Bioss,北京)一抗(1∶1 000稀释)4 ℃孵育过夜，PBST洗膜4 h；加二抗(1∶3 000稀释)37 ℃水浴孵育1 h，PBST洗膜2 h；暗室曝光。

1.5 HPO组织ERα免疫组织化学染色

石蜡切片(厚4 μm)常规脱蜡处理后微波法抗原修复10 min，操作按过氧化物酶标记的链霉卵白素染色试剂盒(Bioss，北京)说明进行。用体积分数3% H2O2湿盒孵育15 min，正常山羊血清工作液37 ℃封闭15 min，ERα抗体稀释液 (1∶800)4 ℃孵育过夜后，37 ℃温箱孵育2 h，再用生物素标记的二抗37 ℃孵育15 min，然后用辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素亲和工作液37 ℃孵育15 min。每次孵育后用PBS(0.01 mol/L，pH=7.4)洗涤3次，每次5 min。DAB(Bioss,北京)显色10 min，苏木精复染，脱水透明后中性树胶封片。阴性对照用PBS代替一抗，其余条件和步骤均相同。染色切片均用Olympus-71型光学显微镜(日本)观察并拍照。

1.6 数据统计

各时期血浆雌激素含量根据回归方程计算得出；RT-qPCR结果用2-ΔΔCt法计算发情周期不同阶段各组织中基因的相对表达量，每个基因表达量均以β-actin内参基因进行校正；Western blot所得蛋白条带灰度值用Image J 软件分析，以ERα与β-actin 蛋白条带灰度值的比值表示ER蛋白的相对量；所有数据均用SPSS 19.0进行方差性分析，结果以“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 血浆雌激素含量变化规律

甘加型藏羊发情周期内血浆雌激素含量检测结果表明，整个发情周期内E2呈现动态变化。由图1可知，发情期和发情后期血浆雌激素呈波动式和脉冲式分泌，且发情期分泌量最高，发情第10 h时达到第1个峰值(97.21±1.78) ng/mL，之后分别在第24 、32、36、42、48、57、66、72小时出现峰值；由图2可知，间情期和发情前期血浆雌激素主要呈波动式分泌，在第6天早上、12天早上、13天晚上和16天早上出现峰值，维持在 47.86～71.82 ng/mL。发情期血浆雌激素平均含量显著高于发情前期和间情期(P<0.05)(表2)。

表2 发情周期各时期平均雌激素含量Table 2 E2 content of Ganjia Tibetan sheep in diestrus and proestrus

2.2 HPO组织中ERα mRNA表达分析

RT-qPCR检测结果显示，甘加型藏羊发情周期不同时期下丘脑、垂体和卵巢组织中均有ERαmRNA表达，且表达差异显著(图 3)。下丘脑(图3-A)中ERαmRNA在发情后期相对表达量最高，间情期最低，发情前期与发情期差异不显著(P>0.05)；垂体(图3 -B)中发情期ERαmRNA相对表达量最高，显著高于其他 3 个时期(P< 0.05)，间情期最低，发情前期与发情后期表达差异不显著(P>0.05)；卵巢(图3-C)中ERαmRNA相对表达量发情前期最高，间情期最低，各时期差异显著(P<0.05)。

2.3 HPO组织ERα蛋白的表达分析

Western blot检测结果显示，甘加型藏羊发情周期内下丘脑、垂体和卵巢组织中均有ERα蛋白表达(图4)。下丘脑ERα蛋白表达量(图4-A)从发情前期开始呈上升趋势，发情后期达到最高，间情期又降低，发情前期最低，发情期与间情期差异不显著(P>0.05)，其他时期均差异显著(P<0.05)；垂体中(图4-B)发情期最高，显著高于间情期(P<0.05) ，发情前期、发情期和发情后期差异不显著(P>0.05)；卵巢(图4-C)中发情前期表达量最高，发情期最低，显著低于其他 3 个时期(P<0.05)。

2.4 HPO组织ERα定位分析

甘加型藏羊发情周期内下丘脑、垂体、卵巢组织的免疫组化结果(图 5)显示，ERα阳性产物为黄色或棕黄色，所有阴性对照组试验样本均为阴性，证明试验选用的ERα一抗具有特异性。

在下丘脑促垂体区大神经元胞体和神经胶质细胞胞核均有ERα分布(图5-A～图5-D)；在垂体远侧部和中间部嗜酸性细胞胞核中ERα高表达，胞浆中表达微弱(图5-F～图5-I)；卵巢中ERα分布于生长卵泡颗粒细胞胞浆和胞核、卵泡内膜细胞及黄体细胞胞浆中(图5-K～图5-N)。

3 讨 论

本研究运用酶联免疫分析法对甘加型藏羊发情周期内血浆雌激素进行检测，发现甘加型藏羊血浆雌激素呈波动式和脉冲式交替分泌，这与葛仕豪等[8]的研究结果一致。提示雌激素参与动物发情周期的调控。甘加型藏羊发情周期血浆雌激素含量发情前期逐渐增加，发情期最高，在发情第10小时达到第1个峰值，说明藏羊在发情第10小时形成排卵前峰，为排卵做准备。之后分别在第24、32、36、42、48、57、66、72小时及第6天早上、12天早上、13天晚上和16天早上出现峰值。海门山羊[15]、波尔山羊[16]及黑白花奶牛[17]等哺乳动物E2在发情当天最高，之后开始下降，到发情前2～3 d开始上升，这与本研究结果相似，可见雌激素在哺乳动物发情周期中具有相同的分泌规律。余四九等[14]指出，绵羊在发情周期第8天左右出现的E2峰值越显著排卵率越高，而本研究结果发现甘加型藏羊第6天早上的峰值不显著，预示排卵率不高，这可能是甘加型藏羊低繁殖率的原因之一。雌激素是由卵巢分泌的一种甾体类激素，是雌性哺乳动物体内重要的激素之一。雌激素随着血液循环扩散与靶器官上特定受体ER结合发挥作用，也可直接作用于靶器官[3]。发情周期中，雌激素可通过正、负反馈作用调节卵巢、下丘脑和垂体等的生理功能[18]。笔者发现，ERαmRNA及其蛋白在甘加型藏羊发情周期内下丘脑中的表达差异显著，且发情后期最高，提示ERα参与藏羊发情周期的调控。最近研究表明，雌激素的反馈作用是借Kisspeptin/GPR54信号系统实现的[19]。雌性绵羊下丘脑弓状核中Kisspeptin神经元介导了雌激素对促性腺激素释放激素(Gonadotrophin-releasing hormone,GnRH)和LH释放的负反馈作用[20]。有研究报道，GnRH神经细胞不表达ERα，而大部分Kiss1细胞表达ERα[21]。结合本研究结果，ERα在甘加型藏羊下丘脑神经胶质细胞胞核和大神经元胞浆高表达，且在发情周期各阶段变化差异显著，与陈卫刚等[22]的研究结果相似，推测ERα通过Kisspeptin/GPR54信号系统参与调控甘加型藏羊发情周期等繁殖活动。

性腺分泌的雌激素以内分泌方式，下丘脑等脑部组织及垂体自身合成的雌激素以旁分泌或自分泌方式作用于腺垂体，使腺垂体FSH和LH的分泌受到影响，进而影响卵巢性激素的合成与分泌，参与调控动物的生殖生理活动[23]。研究表明绵羊下丘脑的弓状核区E2通过非经典信号途径抑制Kisspeptin的表达，从而负反馈调控GnRH的释放[24]。在灵长类动物[25-26]、绵羊[27]和啮齿动物[28-29]中，只有当足够高的E2信号或增加的E2持续几个小时时才会引起LH/GnRH激增，进而诱导ER、GnRHR等的表达。对照本试验结果，发情前期开始，ERαmRNA及其蛋白在垂体中表达量逐渐升高，发情期表达量最高，之后开始下降，到间情期达最低，提示在甘加型藏羊发情周期内ERα的表达可能受到循环的E2的调节。在发情期和发情后期，当E2水平较高时，ERα表达量也升高，提示E2上调ERα的表达。免疫组织化学试验结果显示，ERα阳性反应发情后期垂体远侧部和中间部细胞核分布最多，这与张庆红等[30]的研究结果一致。

卵巢作为主要的雌性生殖器官，兼有外分泌(产生并排出卵子)和内分泌(分泌雌激素和孕酮)的双重功能，在雌性生殖中占主导作用[31-32]。敲除ERα的成年小鼠出现囊肿性或血性卵泡，表现出不孕[33]。孟金柱等[34]研究发现，鸡蛋小黄卵泡液中雌激素含量显著高于其他卵泡液，说明雌激素直接影响卵泡的发育和选择。葛均邦等[35]提出雌激素通过其核受体调控C型钠肽(Natriuretic peptide C,NPPC)/钠肽受体2(Natriuretic peptide receptor 2，NPR2)mRNA水平，参与卵泡发育调节，Chao等[36]也提出雌激素还可通过其核受体影响DNA甲基化水平进而影响卵母细胞的成熟与发育。本研究发现甘加型藏羊发情周期内ERαmRNA及蛋白的相对表达量在发情前期最高，各时期表达差异显著；ERα阳性表达在生长卵泡颗粒细胞胞浆和胞核、卵泡内膜细胞及黄体细胞胞浆中分布，这与孙建红等[37]研究的ERα免疫反应产物在山羊卵巢中的分布结果一致。发情期，优势卵泡发育完全，颗粒细胞开始大量分泌雌激素[18]。推测高浓度的雌激素与ERα结合，促进卵泡的发育及卵母细胞的成熟，其具体作用机理还需进一步研究。

4 结 论

本研究结果显示甘加型藏羊发情周期内血浆中雌激素呈动态变化，表明E2参与甘加型藏羊发情周期的调控。ERαmRNA及其蛋白在整个发情周期HPO组织中均有表达及分布，且表达呈现出差异性，提示下丘脑、垂体和卵巢组织是雌激素参与调控藏羊生殖活动的重要靶点，对藏羊发情周期具有重要的调控作用。