铁皮石斛SEP基因克隆与表达的研究

懂陈文华， 邹玉顺， 赵银河

(云南农业大学作物农学与生物技术学院， 昆明 650201)

在拟南芥中，SEPALLATA1(SEP1),SEP1、SEP2、SEP3和SEP4被命名为E-class MADS-box基因[2-3,5-6]。研究表明SEP类SEP1、SEP2、SEP3和SEP4基因不仅在拟南芥花发育早期表达,还参与四轮花器官的发育，如果这些基因都突变,四轮花器官变成苞片,表明SEP类基因对花器官特征的调控起重要作用[2-3,5-7]。

图1 SEP-A全长基因的电泳

铁皮石斛为石斛之极品，野生“铁皮石斛”， 因其表皮呈铁绿色而得名。铁皮石斛具有独特的药用价值，研究发现石斛有增强体质、清热止痛、强筋健骨、降低血糖、抑制肿瘤、明亮眼目、润养肌肤、延年益寿等功效，被列为“中华九大仙草”之首，民间称其“救命仙草”。其花器官有特异性，主要产地在云南。本研究以铁皮石斛花序作为材料，参考张雪梅等[8]的方法进行。

1 材料与方法

1.1 材 料

采用材料为铁皮石斛(Dendrobiumcandidum)花器官，培养液的配置及所需设备参照文献[8]。

1.2 方 法

1.2.1RNA的提取

选用TransZol Plant，试剂盒参考张雪梅等[8]的方法，提取铁皮石斛花器官的RNA，严格按照试剂盒进行。

1.2.2特异性引物设计

3′-RACE引物参照张雪梅等[8]的方法进行。

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SEP-A-F 5-AGGGAGAGAAAGAGAAAGAAAT-3；

SEP-A-R 5-ACAAGCCACACAAGTGCATAA-3；

SEP-B-F 5-TGAAAAGTGAGCGAACCAGA-3；

SEP-B-R 5- AACATAATAAGGTAGCAAACAAGAA-3；

1.2.3cDNA的合成

按SMART RACE cDNA Amplication Kit操作流程进行，具体方法参考文献[8]

1.2.4电泳检测，割胶回收目的片段

取5 μL的PCR产物进行克隆，克隆方法参照文献[7]进行，随机筛选白色菌落，送北京华大基因公司进行测序。

1.2.5SEP1基因的表达

选用TransZol Plant(TransGen Biotech，Beijing，code#ET 121-01)分别提取幼叶、花萼、花瓣、唇瓣以及合蕊柱的RNA，然后进行cDNA合成和RT-PCR,其引物序列如下：

SEP-A-F 5-ATCACTCAAGTTAGCACACAGCAA-3；

SEP-A-R 5-CTTAACTTCCACCTAGAGATGTCGT-3；

SEP-B-F 5-AGTAATCAGACAGCCCATCAGC-3；

SEP-B-R 5-TTGGAGCAGTCGTTGGTG-3；

PCR反应条件与克隆该基因一样，参照文献[8]的方法进行。

2 结果与分析

2.1 RACE的结果

对铁皮石斛不同发育时期的花序进行转录组测序[8]，分离出 943 bpSEP-AMADS-box全长cDNA(如图1)，包含有完整的编码框，编码243个氨基酸，包含有编码框5′和3′UTR；同样分离出1 021 bpSEP-BMADS-box全长cDNA(如图2)，包含有完整的编码框，编码227个氨基酸，包含有编码框5′和3′UTR。

2.2 序列比对

获得SEPA基因cDNA 全长为 926 bp,包含有编码框,81 bp 5′UTR和161 bp 3′UTR的非翻译区,具有完整的开放阅读框 (ORF)681 bp,编码227氨基酸，该基因序列起始密码子为ATG，如图3。SEPB基因cDNA 全长为954 bp,包含有编码框,39 bp 5′UTR和127 bp 3′UTR的非翻译区,具有完整的开放阅读框 (ORF) 774 bp,编码243氨基酸，该基因序列起始密码子为ATG，如图4。

2.3 SEP1基因在各个花器官的表达

用SEP-A基因靠近3′端的特异引物对铁皮石斛开花前合蕊柱、唇瓣、花瓣、花萼和幼叶的cDNA模板进行RT-PCR，结果如图5，说明SEP-A基因在合蕊柱和唇瓣中表达。

用SEP-B基因靠近3′端的特异引物对铁皮石斛开花前不同发育时期的合蕊柱、唇瓣、花瓣、花萼和幼叶的cDNA模板进行RT-PCR，结果如图6，说明SEP-B基因在唇瓣、花萼和幼叶中表达。

图2 SEP-B全长基因的电泳

图3 SEP-A基因的核苷酸序列和编码的氨基酸序列

3 讨 论

本研究以铁皮石斛为材料分离出SEP-A和SEP-B基因，确定其全长cDNA序列分别为962 bp和954 bp，编码227个和243个氨基酸。获得的序列及其推导的氨基酸序列分析发现其编码的蛋白质属于典型的MADS-box，与从其他植物提取出的SEP基因的同源性很高[3]，因此，具有MADS-box结构域特性和功能[5]。

SEP类基因属于E类基因,在高等真双子叶植物拟南芥中，E-class MADS-box基因包括SEP1、SEP2、SEP3和SEP4，主要参与四轮花器官的发育[5-6]。从意大利红门兰分离的3个AGL6 MADS-box基因OIcomP8201,OIcomP 1386和OIcomP 4335，OIcomP 8201和OIcomP 1386主要在唇瓣和花萼中表达，OIcomP 4335主要在子房和花萼中表达[9-10]。而在铁皮石斛中还没有研究过，从铁皮石斛中分离的基因通过分析，该基因与其他物种中分离出来的SEP1的基因同源性很高[10]。在表达模式上SEP-A主要在合蕊柱和唇瓣中都表达，SEP-B主要在唇瓣、花萼和幼叶中表达，可能与兰科比较复杂的花器官结构有关系。

SEP作为胶着蛋白可以与 A、B、C、D类MADS-box蛋白质互作，蛋白质为基础的“四元体模型”(FQM)的形成[3,5-6,10]。关于蛋白的作用关系还有待进一步研究。

图4 SEP-B基因的核苷酸序列和编码的氨基酸序列

注：1、2、3、4、5分别为幼叶、花萼、花瓣、唇瓣和合蕊柱。