静电纺丝素纳米纤维对大鼠深Ⅱ度烧伤创面愈合的作用*

陈 华， 刘 宁， 沙 娜， 单爱军， 刘海华

深圳市人民医院(暨南大学第二临床医学院，南方科技大学第一附属医院)急诊科，深圳 518020

深Ⅱ度烧伤最常用的治疗措施之一是给创面予以烧伤敷料，其理想性能包括：保护创面、保湿、吸收渗液、不易粘连、防治感染、组织相容性好、促进愈合等，但迄今为止，尚无一种敷料能够具备以上所有性能[1]。静电纺丝技术简称电纺(electrospinning)技术，是一种特殊的纤维制造工艺，其利用聚合物溶液或熔体在强电场中进行喷射纺丝，可以生产出纳米级大分子或者复合分子的纤维。已有研究表明静电纺丝技术制备的纳米纤维膜具有：高孔隙率和高比表面积，与细胞外基质(extracellular matrix，ECM)结构相似，可以更好地模拟皮肤作用，并刺激细胞合成多种细胞因子和生长因子，促进细胞生长和创面愈合等作用[2]。本研究运用静电纺丝技术制作丝素纳米纤维敷料，将这种敷料用于深Ⅱ度烧伤大鼠模型，通过观察并检测其创面愈合情况、创面组织中的新生血管标记物血小板-内皮细胞粘附分子(platelet and endothelial cell adhesion molecules 1，PECAM-1/CD31) 和细胞增殖标记物Ki-67的表达变化，探讨这种新型敷料在烧伤创面愈合中的作用和机制。

1 材料与方法

1.1 静电纺丝素纳米纤维薄膜烧伤敷料

本研究所用静电纺丝素纳米纤维敷料，由西安交通大学生命科学与技术学院张晓慧教授提供。其具体制备方法如下：将桑蚕茧在碳酸钠溶液中煮沸，以蒸馏水彻底冲洗提取丝素蛋白。将提取的丝素蛋白在60℃ 9.3 mol/L的LiBr溶液中溶解4 h，得到20%(W/V)的溶液；室温下使用Slide-a-Lyzer透析盒(MWCO 3500，Pierce)将该溶液用蒸馏水透析48 h以去除盐，将透析液在5℃下离心20 min×2次，以去除透析过程中形成的杂质和聚集体，得到丝素蛋白水溶液的最终浓度约为8%(W/V)；将5.0%(W/V)聚环氧乙烷(PEO)(9×106g/mol)加入体积比为1∶4的8.0%(W/V)丝素蛋白水溶液中，制得7.5%(W/V)的丝素/PEO混合物纺丝液；运用静电纺丝技术将处理后的混合液注入连接静电纺丝机喷射头的注射器中，调节电位、溶液流速和毛细管尖端与收集板之间的距离，将电纺纤维收集在覆盖有铝箔的收集板上；用100%甲醇处理10 min，诱导β-折叠构象转化，使其不溶于水；室温下在蒸馏水中沥滤72 h，去除PEO。

1.2 主要试剂与设备

苏木精-伊红(HE)染色、IHC试剂盒、DAB显色试剂盒、CD31、Ki-67抗体等相关试剂，分别购自武汉谷歌生物科技公司、上海碧云天生物技术有限公司、国药集团化学试剂有限公司、Abcam、DAKO公司。

1.3 实验动物和动物烧烫伤模型建立

SPF级健康雄性SD大鼠60只，体重220～260 g，购自广东省医学实验动物中心[许可证号：SCXK(粤)2018-0002]。本研究经深圳市人民医院实验动物伦理委员会批准，符合动物实验的伦理学要求。所有大鼠分笼适应性喂养1周后，予以3%戊巴比妥钠1.0～1.5 mL/kg腹腔内注射麻醉；麻醉成功后，依次用剃毛刀、脱毛膏处理大鼠背部局部皮肤，75%乙醇消毒；将直径3 cm的金属砝码置入恒温水浴箱加热至95℃，随即将砝码垂直置于大鼠背部备皮处皮肤20 s，建立直径3 cm的烫伤创面(1 d后取烫伤局部组织，经病理切片证实为深Ⅱ度烧伤)，随后立即予以腹腔内注射林格氏液(20 mL/kg)抗休克；大鼠麻醉苏醒后能够自由活动和正常饮食，表明建模成功。

1.4 创面处理

烫伤后，创面局部予以碘伏消毒，实验组创面予以静电纺丝素纳米纤维敷料覆盖，表面再覆盖清洁纱布，胶带固定。对照组创面碘伏消毒后，予以无菌纱布覆盖创面，胶带固定。创面每2天消毒1次，并更换敷料，共治疗21 d。

1.5 标本采集

分别于烫伤后第4、8、14、21天，采用简单随机抽样法，每组选取6只大鼠，3%戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉后，切取烫伤创面全层皮肤组织至浅筋膜层，将剪取组织用10%甲醛固定24 h，石蜡包埋后切片。大鼠取材后随即以脊椎脱臼法处死。

1.6 创面愈合情况和创面愈合率计算

由2名观察员分别于烫伤后当天(第0天)，烫伤后第1、4、8、14、21天观察拍照记录实验组和对照组大鼠创面颜色、分泌物、愈合等情况，并通过Image Pro Plus 6.0图像分析软件测量创面面积，计算创面愈合率。创面愈合率=(治疗前创面面积-治疗后创面面积)/治疗前创面面积×100%。

1.7 HE染色和Masson染色

取创面组织切片进行脱蜡、水化，随后进行HE染色和Masson染色，脱水封片，镜下观察拍照创面组织中炎性细胞、胶原纤维、新生血管等生长情况。

1.8 免疫组织化学法检测CD31、Ki-67表达情况

取创面组织切片，依次进行脱蜡、水化、抗原修复、血清封闭、孵育一抗及相应二抗、清洗、DAB显色、苏木精复染、封片等过程。由2名病理科医师独立阅片，每张切片于显微镜下随机选取3个高倍视野对CD31、Ki-67表达阳性细胞数进行统计。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 静电纺丝素纳米纤维镜下形态

如图1所示，静电纺丝素纳米纤维大体观为白色薄布状纺织物，被甲醇处理后不溶于水。扫描电子显微镜下，纳米纤维具有固体表面，在纤维之间具有相互连接的空隙，呈现出多孔网格状。

2.2 两组大鼠烫伤创面愈合情况

烫伤后第4天，两组创面大小均无明显变化，实验组创面焦痂湿润，少许水肿但无明显渗出；对照组创面焦痂较干燥，出现破溃并有液体渗出。烫伤后第8天，两组创面面积均有所缩小，实验组创面湿润，可见周围少许坏死组织溶解；对照组创面坚硬干燥，破溃、渗出较前明显。烫伤后第14天，两组创面面积明显缩小，实验组创面缩小更显著，焦痂脱落完全，创面周围可见新生上皮组织；对照组焦痂部分脱落，创面缩小，创面周围部分上皮化生长。烫伤后第21天，实验组创面基本愈合，颜色较周围正常皮肤组织深，新生皮肤、毛发生长接近正常；对照组创面部分愈合，焦痂脱落，创面明显缩小。创面愈合过程见图2。

图2 SD大鼠深Ⅱ度烧伤后创面愈合过程Fig.2 The wound healing process of deep second-degree burns in the two groups

2.3 两组大鼠烫伤创面愈合率对比

烫伤后第4、8、14、21天，实验组和对照组创面愈合率见表1，两组烫伤后第8、14、21天创面愈合率比较差异均具有统计学意义(均P<0.01)，实验组创面愈合情况明显优于对照组。

表1 两组大鼠烫伤创面愈合率Table 1 Healing rate of scald wound in the two

2.4 两组大鼠烫伤创面组织HE和Masson染色结果

烫伤后第4天，镜下观察可见两组创面组织中均有炎性细胞浸润，但实验组炎性细胞渗出较少，胶原纤维肿胀；对照组可见大量炎性细胞渗出，胶原纤维降解坏死，角质层、毛囊、皮脂腺等组织结构破坏明显。烫伤后第8天，镜下观察可见两组创面组织中炎性细胞浸润较前明显增加，实验组可见表皮细胞和成纤维细胞明显增加，并可见毛细血管新生；对照组可见少量表皮细胞增生和新生血管。烫伤后第14天，实验组镜下显示表皮细胞排列整齐，上皮化完整，皮肤层次清晰，毛囊、皮脂腺、新生血管等附属结构完整；对照组仍可见炎性细胞浸润，皮肤表层可见变性坏死组织，上皮化不完整，皮肤层次不清晰，毛囊、皮脂腺、血管等附属结构不完整。烫伤后第21天，实验组可见表皮结构完整，表皮细胞基本覆盖创面，基底细胞排列整齐结合紧密，层次清晰，胶原纤维量多且排列有序，可见较多新生血管，和正常完整皮肤相似；对照组显示表皮结构不完整，创面无完整表皮细胞覆盖，可见上皮细胞向中央爬行，较多成纤维细胞和排列紊乱的大量胶原纤维，及新生血管形成(图3、图4)。

图3 SD大鼠深Ⅱ度烧伤后创面HE染色(×100)Fig.3 HE staining of tissues after deep second-degree burns in the two groups (×100)

图4 SD大鼠深Ⅱ度烧伤后创面Masson染色(×200)Fig.4 Masson staining after tissues after deep second-degree burns in the two groups (×200)

2.5 两组大鼠烫伤创面组织CD31免疫组化染色结果

烫伤后第4、8、14天，两组大鼠创面组织镜下显示新生血管逐渐增多，血管内皮细胞围绕血管壁排列，血管腔清晰，细胞胞核蓝染，细胞质部分被深染成棕黄色，主要呈胞质阳性，阳性染色细胞数量依次增加，可见实验组新生血管数量及阳性染色血管内皮细胞比对照组多。烫伤后第21天，两组大鼠创面组织镜下显示新生血管数量和阳性染色细胞数量较前有所减少，对照组较实验组减少更加明显(图5)。

图5 SD大鼠深Ⅱ度烧伤后创面免疫组织化学法CD31染色结果(×400)Fig.5 CD31 staining results of immunohistochemical method on wounds of two groups(×400)

2.6 两组大鼠烫伤创面组织Ki-67免疫组化染色结果

烫伤后第4、8、14天，两组大鼠创面组织镜下显示细胞胞核蓝染，部分细胞核内可见棕色颗粒，染色结果为阳性，并且数量逐渐增多，实验组较对照组阳性染色细胞数量更多。烫伤后第21天，两组大鼠创面组织镜下显示阳性染色细胞数量较前有所减少，对照组较实验组减少更加明显(图6)。

图6 SD大鼠深Ⅱ度烧伤后创面免疫组织化学法Ki-67染色结果(×400)Fig.6 Ki-67 staining results of deep second-degree burns wound in the two groups(×400)

3 讨论

本研究建立SD大鼠深Ⅱ度烫伤模型，观察静电纺丝素纳米纤维敷料的治疗效果，结果显示其能够缩短烫伤创面愈合时间，提高创面愈合率。同时发现，静电纺丝素纳米纤维敷料促进创面组织中CD31和Ki-67的表达，增加了创面血管新生数量及细胞增殖能力，这可能是其促进创面愈合的机制。

CD31属于免疫球蛋白超家族成员，通常位于血管内皮细胞、血小板、中性粒细胞、单核细胞和某些类型的T细胞表面，以及内皮细胞间紧密连接处，与血管生成和内皮细胞运动相关。在免疫组化检测中，CD31主要用于证明内皮细胞的存在，常用于评估组织中新生血管生成和数量[3-5]。Ki-67是一种核蛋白，和细胞增殖密切相关。主要表达于细胞周期中的有丝分裂间期以及分裂期(G1、S、G2、M期)，但有丝分裂静止期(G0期)该蛋白不表达。Ki-67半衰期短，G1期及S期早期，表达水平较低，S期及G2期表达急剧上升，在M期达到峰值，随后在细胞分裂后期和末期表达迅速下降，脱离增殖周期后迅速降解，这些特点使其成为反映细胞增殖能力的常用分子标记物[6-8]。经研究发现，静电纺丝素纳米纤维敷料能够增加创面组织中CD31和Ki-67的表达，促进血管新生和细胞增殖，改善局部创面血供，加速创面愈合。HE染色也显示，经治疗后大鼠创面皮肤结构恢复完整，层次清晰，上皮化完成较好。之前有研究报道，丝素蛋白纳米纤维能够良好地模仿细胞外基质，促进组织细胞增殖和血管新生[9]，负载纳米氧化锌颗粒的丝素胶原蛋白支架能够促进皮肤创面修复，我们的实验结果与其一致[10]。

综上所述，静电纺丝素纳米纤维敷料有望成为一种新的创面敷料用于深Ⅱ度烧伤创面治疗，但其具体分子机制还需要进一步深入研究。