替米考星在猪尿液与体内组织间残留分布规律研究及相关性分析

余军军，梁立杰，蓝棋浩，陈秋月，章 敏，宁 军，韦 田通信作者

(1.温氏食品集团股份有限公司，广东 新兴 527400；2.广东省畜禽健康养殖与环境控制企业重点实验室，广东 新兴 527400；3.华南农业大学兽医学院，广东 广州 510642)

0 引言

替米考星(Tilmicosin，TILM)是由泰乐菌素的一种水解产物半合成的畜禽专用抗生素，该药首先由英国ELanco动物保健品公司在20世纪80年代开发成功，目前在多个国家批准用于畜禽生产中疾病的预防和治疗[1]。替米考星为广谱抗菌药，因其体内分布广、半衰期长、肺部高蓄积等特点，临床主要用于治疗牛、山羊、猪、鸡等动物呼吸系统疾病，特别用于治疗和控制由鸡毒支原体、猪胸膜肺炎放线杆菌和多杀性巴氏杆菌引起的鸡猪呼吸道疾病[2]。替米考星具有肝、肾毒性，并可损害人体前庭和耳蜗神经，长期使用可引起过敏反应和导致携带耐药因子的菌株扩散。因此，中国对动物源食品中替米考星的最大允许残留限量(MRL)做了严格规定[3]。目前，监控替米考星残留主要用动物的可食用组织[4]，尿液中替米考星残留的消除未见有相关报道。本试验旨在研究猪组织和尿液中替米考星残留分布规律，探讨替米考星残留量在尿液与体内组织间的相关性，预测体内替米考星消除安全时尿液中替米考星残留量，为活体快速检测提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 仪器设备与试剂

液相色谱串联质谱仪(QQQ6410B)，美国Agilent科技有限公司；组织匀浆机(HM6300)，北京Lab Precition科技有限公司；氮吹仪(MV5)，北京莱伯泰科仪器有限公司；电子分析天平(BT125D)，德国Sartorius集团；冷冻高速离心机(5804R)，德国Eppendorf公司；HLB固相萃取小柱(500 mg/6 CC)，美国Waters公司。

替米考星对照品(纯度98.0%，德国Dr.公司)；甲醇、乙腈和甲酸(色谱纯，德国默克公司)；正己烷、碳酸钠、甲酸、甲基叔丁基醚、乙酸铵和甲酸铵(分析纯，广州化学试剂厂)；替米考星预混剂(含量20%，广东温氏大华农科技有限公司)。

1.1.2 试验动物的饲养与管理

选择健康、体重相近的三元杂商品猪21头(40.0±1.5 kg)，随机分成2组，分别为对照组1头、实验组20头。实验组在基础饲料基础上添加2 g/kg的替米考星预混剂，连续饲喂15 d。实验组自停药后第5、8、12、15天随机选择5头猪，采集肌肉、肝脏、肾脏、肺脏、皮脂和尿液作为检测样品。

1.2 分析方法

1.2.1 溶液配制

替米考星储备液(1 mg/mL):称量50 mg替米考星对照品，置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，置4℃冰箱中保存。使用时配成不同浓度的标准工作液。

4%磷酸二氢钠溶液:准确称取二水合磷酸二氢钠4 g置于100 mL容量瓶中，用纯水溶解定容至刻度，摇匀，即得。

5%甲醇水溶液:移取50 mL甲醇置1 000 mL容量瓶中，用纯水稀释定容至刻度，摇匀，即得。

20%乙腈水:移取20 mL乙腈置100 mL容量瓶中，用纯水稀释定容至刻度，摇匀，即得。

1.2.2 样品处理

尿液样品:取1 mL尿液样品，加入1 mL 4%磷酸二氢钠溶液，涡旋混匀30 s，8 000 r/min离心10 min，上清液过经甲醇、水活化的HLB萃取小柱，用6 mL 5%甲醇水溶液淋洗，6 mL甲醇洗脱。洗脱液50℃水浴中氮气吹干，残渣用1 mL 20%乙腈水溶液复溶，过膜，待测。

组织样品:准确称取4.0 g试样置于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈，涡旋30 s，超声提取20 min，4 500 r/min离心10 min，上清液移入50 mL离心管中。用10 mL乙腈重复提取一次，合并上清液，混匀。取5 mL提取液，50℃下氮气吹至近干，残渣加入5 mL 20%乙腈水溶液，5 mL正己烷涡旋混匀后4 000 r/min离心10 min，移除正己烷层，下层液体按尿液样品项下净化。

1.2.3 仪器条件

色谱条件:色谱柱Agilent Zorbax Eclipse Plus C18色谱柱(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)；流动相0.2%甲酸水溶液:0.2%甲酸乙腈溶液(v:v，30:70)；流速为0.25 mL/min；柱温为35℃；进样体积为5 μL。

质谱条件:电喷雾离子源(ESI)，正离子模式；扫描方式:多反应监测(MRM)；毛细管电压4.0 kV，雾化气压力55 psi；脱溶剂气流速10 L/min；脱溶剂温度350℃；替米考星的质谱信息，如表1所示。

表1 替米考星的质谱信息

2 结果与分析

2.1 组织中替米考星残留及消除规律

不同时间点各组织中替米考星残留量如表2所示。结果显示，20%替米考星预混剂按推荐剂量连续用药15 d后，替米考星在肝脏、肾脏和肺脏中的残留量较高，在肌肉、皮脂中的残留量低，停药8 d后，替米考星在各组织中残留量低于MRL。猪只停药后替米考星在各组织中残留消除速度不同，其中肺脏、肝脏和肾脏中的下降速度快，而肌肉、皮脂中的下降趋势相对平缓，但也都呈现出明显的下降趋势。

表2 猪停药后不同时间点体内各组织和尿液中替米考星的残留浓度量(n=5)

2.2 休药期计算

按照农业部关于替米考星最大残留限量[3]和欧盟对休药期计算的有关规定[5]，利用WT1.4软件按双单侧95%置信区间计算替米考星在猪组织中休药期。恩诺沙星在各组织中的休药期如表3所示。结果显示，替米考星在猪肺脏中消除最慢，休药期为16.71 d；肌肉中替米考星消除最快，休药期为7.25 d。

表3 替米考星在各组织中休药期

2.3 尿液、组织中替米考星残留量相关性研究

以停药后尿液中替米考星含量为横坐标，各组织中替米考星的含量为纵坐标进行线性回归分析，结果如图1所示。结果显示，停药后尿液中替米考星残留量与猪体内各组织中替米考星残留量相关系数r>0.96，且p<0.05，表明尿液中与各组织中替米考星残留具有高度的相关性。

2.4 尿液中替米考星残留量区间预测

根据相关性分析得到的回归方程，利用R软件中的predict()函数计算组织中替米考星残留量为MRL时相对应尿液中替米考星残留量值的平均值与其置信区间为0.99的预测区间[6]，计算结果如表4所示。结果显示，当体内组织中替米考星残留量为MRL时，尿液中替米考星残留量预测范围8.71～398.11 μg·L-1。

表4 尿液中替米考星残留量预测范围

A—肺脏；B—肾脏；C—肝脏；D—肌肉；E—皮脂

3 讨论

由于在《动物性食品中兽药最高残留限量》中没有对肺脏中替米考星的最高残留限量进行要求[3]，考虑到食品安全风险，同时参考肉中替米考星MRL暂定猪肺脏中MRL为100 μg·kg-1，最后计算得休药期为17 d，与《兽药典》规定14 d差异不大[7]。

在实际生产中，通过对猪活体尿液样品的检测，根据建立的回归方程，可以间接判断猪体内替米考星残留量是否低于最大残留限量。20世纪末开始已有不少学者采用这种经典回归法来预测组织中药物的残留浓度，研究对象除动物尿液[8]、血液[9]外，已扩展到动物毛发、视网膜以及趾甲等[10]，但在研究时均没有考虑个体间和个体内的差异，试验的重复性较差。作者在经典回归法的基础上引入置信区间预测，考虑了个体间差异，通过计算发现当组织中替米考星浓度降至MRL时，尿液中替米考星残留量区间下限为8.71 μg·L-1，较经典回归法计算的最低浓度11.75 μg·L-1更安全，更符合动物可食组织中残留研究。