HPLC法测定复方氨基酸(15)双肽(2)注射液中醋酸盐和枸橼酸盐的含量

王艳敏，王娜，于黎鑫，常征

(山东齐都药业有限公司，山东 淄博 255400)

复方氨基酸(15)双肽(2)注射液由德国费森尤斯卡比有限公司原研开发，在临床上用于肠外营养。复方氨基酸(15)双肽(2)注射液为15种氨基酸(丙氨酸、精氨酸、门冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、醋酸赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸)和2种二肽(甘氨酰-L-谷氨酰胺、甘氨酰-L-酪氨酸)制成的灭菌水溶液。醋酸为赖氨酸醋酸盐引入，枸橼酸作为pH调节剂。为保证产品质量，需对醋酸盐和枸橼酸盐进行研究和控制。

目前该产品未收载入国外药典，仅收载于《中国药典》2020年版(二部)，但未对醋酸盐和枸橼酸盐进行控制。现有的醋酸盐和枸橼酸盐的检测方法主要有高效液相色谱法[1-3]、滴定法[4-5]、紫外-可见分光光度法[6-7]、离子色谱法[8-9]等。滴定法最为常见和简便，但该产品成分复杂，导致干扰严重。紫外-可见分光光度法通常需要配合衍生化法进行检测，原研厂家德国费森尤斯卡比有限公司本品进口药品注册标准(JX20030306)中借助德国Boehringer Mannheim公司的试剂盒采用酶催化法对醋酸盐和枸橼酸盐进行质量控制，但酶催化法存在操作复杂，测定结果误差大等缺点。离子色谱法和高效液相色谱法更适合该产品的检验和控制，李盼盼等[10-11]对该产品的研究中分别采用高效液相色谱法控制醋酸盐含量和离子色谱法控制枸橼酸盐含量，其中高效液相色谱法采用只控制了醋酸盐一种成分，采集时间较长，流动相中使用的硫酸为强腐蚀性液体，配制时称量操作较危险；而枸橼酸盐的控制需使用离子色谱仪，普适性较差。因此，我们在对该产品进行质量研究时，在宁洪鑫等[13]研究方法的基础上进行方法优化，建立合适的高效液相色谱法，控制醋酸盐和枸橼酸盐含量，该方法采集时间大大缩短，节省了检验成本，并且流动相配制采用调节pH值法相较于称量方法更加简便和安全。经详细的方法学验证，该方法操作简便、精密度好、准确度高，可用于复方氨基酸(15)双肽(2)注射液中醋酸盐和枸橼酸盐含量的测定。

1 仪器与试药

1.1 仪器 岛津LC-20A高效液相色谱仪；CPA225D电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；FE20型pH计(梅特勒-托利多公司)。

1.2 试药 醋酸对照品(批号：AL160809-18，纯度：99.81%，Stanford Chemicals)、枸橼酸对照品(批号：100396-201603，纯度：100.0%，中国食品药品检定研究院)；复方氨基酸(15)双肽(2)注射液(山东齐都药业有限公司，批号：17060801、17060802、17060803)；硫酸为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为菲罗门Rezex ROA-Organic Acid H+(7.8 mm×300 mm，8 μm)；流动相：以水(用硫酸调节pH值至2.7，必要时可调节pH值使各峰能分离)为流动相；检测波长：210 nm；流速：0.6 mL·min-1；柱温：60 ℃；进样量：10 μL。各色谱峰之间分离度符合要求。

2.2 溶液的制备

2.2.1 空白辅料溶液 按制剂处方配制不含枸橼酸和赖氨酸醋酸盐的溶液。

2.2.2 对照品溶液 分别取醋酸和枸橼酸对照品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1 mL中分别含醋酸约1.85 mg和枸橼酸约1.25 mg的溶液，作为醋酸对照品贮备液和枸橼酸对照品贮备液。从中各取适量，加水稀释制成每1 mL中含醋酸约0.37 mg和枸橼酸约0.25 mg的混合溶液，作为混合对照品溶液。

另取醋酸对照品贮备液和枸橼酸对照品贮备液各适量，加水稀释制成每1 mL中含醋酸约0.37 mg和枸橼酸约0.25 mg的溶液，作为醋酸对照品溶液和枸橼酸对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液 精密量取本品5 mL，置50 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.3 专属性试验 取空白溶剂水、空白辅料溶液、醋酸对照品溶液、枸橼酸对照品溶液、混合对照品溶液、供试品溶液，依法注入液相色谱仪，记录色谱图。

试验结果表明，在该色谱条件下，枸橼酸盐峰与醋酸盐峰的保留时间分别在8.446 min和15.850 min左右，与制剂中的其他各成分峰不形成干扰，空白溶剂水也不干扰测定，专属性试验符合要求，结果见图1。

2.4 检测限和定量限试验 取醋酸对照品溶液、枸橼酸对照品溶液，加水逐步稀释，并依法注入液相色谱仪，记录色谱图。

当信噪比S/N不小于10时，确定此浓度为定量限，将定量限溶液进一步稀释，以信噪比S/N≥3确定检测限。试验结果：醋酸盐和枸橼酸盐的定量限分别为7.4 μg·mL-1和4.2 μg·mL-1，检测限分别为1.85 μg·mL-1和1.0 μg·mL-1。

2.5 线性和范围试验 精密称取醋酸和枸橼酸对照品各适量，加水溶解并定量稀释制成每1 mL中含醋酸盐约740 μg，枸橼酸盐约500 μg的混合溶液，作为混合对照品贮备液；从中分别精密量取3、4、5、6、7 mL，各置10 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为系列线性溶液。分别依法进样，记录色谱图。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程。醋酸盐回归方程为Y=589.26X-511.40(r=0.999 9)，枸橼酸盐回归方程Y=1 069.3X+680.90(r=0.999 9)。试验结果表明，醋酸盐在222～518 μg·mL-1、枸橼酸盐在145.2～338.8 μg·mL-1的浓度范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系。

2.6 重复性试验 取本品，按“2.2.3”项下制备供试品溶液，平行6 份。分别依法进样，记录色谱图，按外标法计算醋酸盐和枸橼酸盐的含量。6 次测量结果表明醋酸盐的平均含量为3.68 mg·mL-1，RSD为0.17%；枸橼酸盐的平均含量为2.66 mg·mL-1，RSD为0.10%，结果表明该方法重复性良好。

2.7 准确度试验 按复方氨基酸(15)双肽(2)注射液的处方，制备分别含赖氨酸醋酸盐和枸橼酸盐处方量的80%、100%、120%浓度的混合溶液，分别依法进样，记录色谱图。以峰面积计算醋酸盐和枸橼酸盐的回收率，结果见表 1。

试验结果表明，醋酸盐的平均回收率为100.45%，RSD为0.44%；枸橼酸盐的平均回收率为99.96%，RSD为0.52%，符合验证要求，该方法准确度良好。

2.8 溶液稳定性试验 取“2.2.2”项下混合对照品溶液室温放置8 h，分别于0、2、4、6、8 h取样，依法检验。试验结果表明，混合对照品溶液室温放置8 h，醋酸盐及枸橼酸盐峰面积的RSD分别为0.46%、0.13%，溶液稳定性良好。

2.9 耐用性试验 改变流速(±0.05 mL·min-1)、流动相pH值(±0.05)、色谱柱(不同批次)等色谱条件参数，评估醋酸盐和枸橼酸盐含量测定结果的影响程度。试验结果表明，改变流速、流动相pH值，醋酸盐峰及枸橼酸盐峰与其他峰之间分离度变差；但换用不同批次的色谱柱，分离情况良好，故需严格控制流速、流动相pH值等参数，如测定过程中出现峰不能良好分离时，可适当调整流速、流动相pH值等，可使测定结果良好。

2.10 样品测定 对3 批中试规模复方氨基酸(15)双肽(2)注射液样品(批号：17060801、17060802、17060803)依法进行测定，结果见表 2。

表2 醋酸盐和枸橼酸盐含量测定结果

3 讨论

复方氨基酸(15)双肽(2)注射液中成分较复杂，原研厂家采用试剂盒-酶催化法对醋酸盐和枸橼酸盐进行质量控制，但操作较烦琐，且测定结果误差较大。其他均无采用同一检测方法同时控制醋酸盐和枸橼酸盐含量的参考文献或研究。我们研究时，采用高效液相色谱法，氢型阳离子交换树脂色谱柱等，建立合适的醋酸盐和枸橼酸盐的检测方法。经详细全面的方法学研究，该方法操作简单，测定结果准确度高，重复性好，可用于复方氨基酸(15)双肽(2)注射液中醋酸盐和枸橼酸盐的含量测定。